白三葉種質(zhì)資源形態(tài)變異與地理起源的關(guān)系

李 州，彭 燕，張婧源，馬 嘯

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川 雅安625014）

白三葉（Trifoliumrepens）為豆科（Leguminosae）三葉草屬中具有重要農(nóng)藝價(jià)值的多年生牧草，原產(chǎn)于歐洲、北非和亞洲西部，在溫帶及亞熱帶地區(qū)均有分布，是世界各地栽培利用最為廣泛的豆科牧草之一，尤以新西蘭、澳大利亞、歐洲西北部、北美東部等地區(qū)栽培面積最大，在我國(guó)東北、西北、西南及長(zhǎng)江中下游等地均有栽培。白三葉生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng)，品質(zhì)優(yōu)良，適宜與多種禾草混播種植，刈割和耐牧特性好，在草地畜牧業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位。近年來(lái)，由于白三葉的匍匐生長(zhǎng)特性及突出的生物固氮能力，亦被廣泛應(yīng)用于園林綠化、水土保持、培肥地力等，被農(nóng)業(yè)部列為向全國(guó)推廣果園生草覆蓋技術(shù)的首選草種，在國(guó)內(nèi)環(huán)境和生態(tài)建設(shè)中發(fā)揮著重要作用。

白三葉為天然異源四倍體植物，具自交不親和性。因此，在遺傳組成上具有高度雜和的特性，無(wú)論是種群內(nèi)還是種群間皆具有豐富的遺傳變異，其形態(tài)特征可塑性較大［1］。此外，白三葉廣泛分布于世界各地，適應(yīng)生境具有多元化特點(diǎn)［2］。種質(zhì)資源收集與遺傳多樣性研究是品種改良和育種的基礎(chǔ)，因而，白三葉種質(zhì)資源收集及包括形態(tài)多樣性在內(nèi)的農(nóng)藝性狀和遺傳多樣性一直受到國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究者的重視。為了改良新西蘭白三葉品種特性，Widdup等［3］從美國(guó)收集了98個(gè)白三葉居群，并初步評(píng)價(jià)其農(nóng)藝性狀。Dzene等［4］從世界各地收集白三葉材料，以篩選優(yōu)良白三葉種質(zhì)改良本國(guó)現(xiàn)有品種。此外，美國(guó)、澳大利亞及歐洲各國(guó)都較系統(tǒng)地收集和研究了白三葉種質(zhì)資源［5-9］，而我國(guó)對(duì)白三葉種質(zhì)資源的收集及其遺傳多樣性報(bào)道相對(duì)較少。安曉珂［10］研究了新疆野生白三葉與三葉草屬其他種的遺傳多樣性及遺傳關(guān)系，何?。?1］初步評(píng)價(jià)了從國(guó)內(nèi)外收集的62份白三葉種質(zhì)資源的遺傳多樣性，吳海濤［12］評(píng)價(jià)了從俄羅斯引進(jìn)的18份野生白三葉種質(zhì)資源的生長(zhǎng)適應(yīng)性、飼用性和景觀(guān)坪用性，Xian等［13］對(duì)采自國(guó)內(nèi)中部、西南和西北部的14個(gè)白三葉居群進(jìn)行了形態(tài)特征和分子遺傳多樣性研究，切彩等［14］分析了新疆11份野生白三葉的形態(tài)變異，張婧源等［15］應(yīng)用SRAP分子標(biāo)記研究了原產(chǎn)于世界各地的41份白三葉種質(zhì)的遺傳變異。本研究以收集到的源自29個(gè)國(guó)家的68份野生白三葉種質(zhì)為試材，研究其主要形態(tài)特征變異，并分析不同起源地白三葉形態(tài)變異分化趨勢(shì)，以期為篩選出不同用途優(yōu)良的白三葉種質(zhì)及為白三葉核心資源庫(kù)的建立提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 供試材料 供試材料源自29個(gè)國(guó)家，共計(jì)68份，材料編號(hào)及來(lái)源見(jiàn)表1。

1.2 觀(guān)測(cè)指標(biāo)與方法 2008年8月取50粒白三葉種子于智能光照培養(yǎng)箱中催芽，幼苗在沙盤(pán)中培育1個(gè)月左右，2008年10月上旬將幼苗移栽至田間試驗(yàn)地，試驗(yàn)地位于四川洪雅陽(yáng)平種牛場(chǎng)試驗(yàn)區(qū)，小區(qū)面積1m×1m，每小區(qū)移栽10株，株間距10 cm，重復(fù)3次。于2009年白三葉開(kāi)花期進(jìn)行觀(guān)測(cè)，每小區(qū)觀(guān)測(cè)10株。株高（cm）為地面至植株頂部的自然高度；生殖枝高（cm）為地面至生殖枝頂部的自然高度；用數(shù)碼照相機(jī)拍下距匍匐莖末端倒數(shù)第3葉的中間小葉，并用Photoshop軟件分析小葉面積（cm2）；觀(guān)測(cè)每小區(qū)開(kāi)花的花序數(shù)，開(kāi)花后，連續(xù)觀(guān)測(cè)4周，取平均值得到單位面積花序數(shù)；每小區(qū)隨機(jī)取5個(gè)完全開(kāi)放的花序，觀(guān)測(cè)其小花數(shù)，連續(xù)觀(guān)測(cè)4周，取平均值得每花序小花數(shù)。

表1 供試白三葉種質(zhì)及來(lái)源Table 1 Serial number and origin of Trifolium repens accessions

續(xù)表1

1.3 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)方法 采用Microsoft office Excel 2003對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；用SPSS 11.0軟件按歐氏距離對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析；用NTSYS-pc program計(jì)算遺傳相似性系數(shù)矩陣和地理距離矩陣，用Mantel test檢驗(yàn)兩者的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試白三葉種質(zhì)形態(tài)變異 通過(guò)對(duì)68份白三葉種質(zhì)資源的5個(gè)形態(tài)特征進(jìn)行基本統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明（表2），不同材料之間存在很大差異，表現(xiàn)出明顯的形態(tài)多樣性。葉面積的變異最大，變異系數(shù)高達(dá)69.48%，其次是單位面積花序數(shù)和株高，變異系數(shù)分別為50.24%和44.30%，而生殖枝高度和每花序小花數(shù)變異較小，變異系數(shù)分別為19.90%和18.81%。

供試材料平均株高為12.29cm，最高為23.27 cm，最低僅為1.34cm，變異較大。生殖枝和株高相比，表現(xiàn)為3種情況，一是明顯高于株叢，二是比株叢稍高，三是低于株叢。生殖枝平均高度為18.04 cm，最高為27.36cm，最短為9.50cm，變異較小。葉片大小變異最大，葉面積最大為18.44cm2，最小為0.23cm2，平均值為6.98cm2。68份白三葉開(kāi)花能力差異很大，單位面積花序數(shù)平均為26.95個(gè)·m-2，最多可達(dá)50.17個(gè)·m-2，最少僅為2.67個(gè)·m-2。每花序小花數(shù)的變異最小，平均值為65.75個(gè)，最多為87.64個(gè)，最少為36.00個(gè)。

2.2 形態(tài)特征與地理距離的相關(guān)性分析Mantel檢驗(yàn)表明，白三葉形態(tài)變異受地理環(huán)境的影響（表3），綜合指標(biāo)（包括株高、生殖枝高度、葉面積、單位面積花序數(shù)和每花序小花數(shù)5個(gè)指標(biāo)）、株高、單位面積花序數(shù)、每花序小花數(shù)特征變化存在空間相關(guān)性，且綜合指標(biāo)、單位面積花序數(shù)、每花序小花數(shù)達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），株高達(dá)到顯著水平（P＜0.05），而生殖枝高度、葉面積相關(guān)性不顯著。

表2 白三葉種質(zhì)形態(tài)特征及變異Table 2 Morphological characteristics and variations in Trifolium repens accession for test

續(xù)表2

表3 白三葉形態(tài)特征與地理距離相關(guān)性的Mantel檢驗(yàn)Table 3 Mantel test between morphological characters and geographical distance of Trifolium repens

2.3 聚類(lèi)分析 對(duì)供試材料形態(tài)特征按歐氏距離進(jìn)行聚類(lèi)分析的結(jié)果見(jiàn)圖1，不同材料可明顯地劃分為4個(gè)類(lèi)群，不同類(lèi)群形態(tài)特征值見(jiàn)表4。第1類(lèi)群包括33份材料，除1份亞洲材料和3份非洲材料外，其余29份全部來(lái)自歐洲，植株高度和生殖枝高度分別為（13.37±3.49）cm、（18.38±1.91）cm，葉面積為（6.24±2.74）cm2，單位面積花序數(shù)和每花序小花數(shù)較多，分別為（36.33±5.90）個(gè)·m-2和（72.98±4.96）個(gè)，表現(xiàn)為植株較高，中到小葉型葉片，有性繁殖能力較強(qiáng)；第2類(lèi)群包括15份材料，其中亞洲10份（東亞4份，中亞4份，南亞、西亞各1份），歐洲（南歐）5份，形態(tài)指標(biāo)為植株和生殖枝最低矮，分別為（4.92±2.08）cm 和（15.52±3.80）cm，葉面積最小，為（1.81±1.09）cm2，單位面積花序數(shù)較少，每花序小花數(shù)最少，分別為（20.51±8.26）個(gè)·m-2、（49.29±9.98）個(gè)，此類(lèi)白三葉表現(xiàn)為植株低矮、小葉型、有性繁殖能力較弱；第3類(lèi)群包括17份材料，全部來(lái)自亞洲，其中，西亞12份，中亞3份，南亞2份，植株和生殖枝高度分別為（15.11±4.87）cm、（18.17±3.90）cm，葉片較大，面積為（11.37±4.44）cm2，單位面積花序數(shù)最少，而每花序小花數(shù)較少，分別為（10.48±5.97）個(gè)·m-2

和（62.71±7.62）個(gè)，表現(xiàn)為植株較高，葉片中到大葉型、有性繁殖能力較弱；第4類(lèi)的3份材料，分別來(lái)自歐洲的德國(guó)、南歐的希臘和斯洛文尼亞，各形態(tài)指標(biāo)均為最大值，株高、生殖枝高、葉面積、單位面積花序數(shù)和每花序小花數(shù)分別為（19.11±0.50）cm、（26.24±0.97）cm、（16.07±2.23）cm2、（49.25±0.83）個(gè)·m-2、（85.71±1.83）個(gè)，表現(xiàn)為植株高大、大葉型、有性繁殖能力強(qiáng)。

圖1 白三葉種質(zhì)資源形態(tài)特征聚類(lèi)圖Fig.1 Morphological clustering analysis of Trifolium repens accessions

表4 不同類(lèi)群白三葉形態(tài)特征Table 4 Morphological characters of different groups for Trifolium repens accessions

3 討論與結(jié)論

3.1 白三葉分布生境特點(diǎn) 白三葉起源于歐洲地中海地區(qū)，由于動(dòng)物遷移等，傳播至歐洲和西亞各地。目前，在年降水量大于750mm的溫帶地區(qū)都有分布［16］。本研究中，供試白三葉主要分布于東半球和北半球的中低緯度區(qū)域，尤以大于30°的中緯度和海拔1 000～2 000m的區(qū)域最為豐富。相關(guān)分析亦顯示，白三葉分布地的緯度與經(jīng)度、緯度與海拔呈顯著負(fù)相關(guān)，而經(jīng)度與海拔呈顯著正相關(guān)。由此可見(jiàn)，白三葉分布的地理環(huán)境與白三葉生態(tài)習(xí)性相吻合，即白三葉喜冷涼-溫暖的氣候條件。

3.2 白三葉形態(tài)變異與生長(zhǎng)特性的關(guān)系 葉片大小是區(qū)分白三葉類(lèi)群的重要特征。按葉片大小白三葉可分為小葉、中葉、大葉和拉丁諾4個(gè)類(lèi)型［17］。本研究顯示，在白三葉形態(tài)變異中，葉片大小的變異最大。聚類(lèi)形成的4個(gè)類(lèi)群，葉片呈從小到大的梯度變化。除葉片外，白三葉株高和單位花序數(shù)的變異亦較大，這與Jahufer等［6］對(duì)澳大利亞的439份白三葉種質(zhì)形態(tài)特征的研究結(jié)果相一致。株高比其他特征的變異相對(duì)較大，表明白三葉生長(zhǎng)高度和開(kāi)花特性的可塑性較大，易受環(huán)境的影響而發(fā)生變化。在本研究中，生殖枝高度和每花序小花數(shù)變異相對(duì)較小，這可能與植物繁殖特性主要受遺傳制約而相對(duì)保守有關(guān)。在研究的形態(tài)特征中，除葉面積與單位面積花序數(shù)外，其余形態(tài)特征兩兩之間呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），即大葉型的白三葉植株高大，開(kāi)花時(shí)生殖枝亦較高，每花序小花數(shù)多，有性生殖能力較強(qiáng)，而小葉型的白三葉則植株低矮，有性生殖能力較弱。Finne等［9］也有類(lèi)似報(bào)道，即白三葉葉叢高度與小葉長(zhǎng)度和干物質(zhì)產(chǎn)量呈兩兩正相關(guān)，種子產(chǎn)量與葉叢高度呈正相關(guān)。

3.3 白三葉形態(tài)變異與地理起源關(guān)系 白三葉形態(tài)多樣性與分布生境的多元化有關(guān)18。本研究的Mantel相關(guān)分析表明，白三葉形態(tài)變化與地理環(huán)境之間存在顯著相關(guān)性。國(guó)外有關(guān)白三葉形態(tài)與分布生境相互關(guān)系的報(bào)道較多。沿地中海盆地，白三葉葉片的大小梯度與溫度和水分有關(guān)［18］。小葉型的主要見(jiàn)于北部地區(qū)，如英國(guó)，葉片較大的拉丁諾主要分布于意大利北部，而葉片更大的白三葉則出現(xiàn)在歐洲南部和地中海。就緯度和海拔而言，小葉白三葉主要分布于高緯度和高海拔地區(qū)，大葉白三葉則分布于南部和低海拔地區(qū)［17-18］。并與 Widdup等［3］報(bào)道的美國(guó)白三葉種質(zhì)形態(tài)變異相一致，即白三葉葉片隨緯度和海拔升高而變小，低緯度和低海拔地區(qū)，葉片最大。本研究顯示，單位面積花序數(shù)、每花序小花數(shù)與地理距離呈極顯著相關(guān)性，株高與地理距離呈顯著相關(guān)性。

進(jìn)一步的聚類(lèi)結(jié)果顯示，源于歐洲和亞洲的大部分材料，分別聚為不同的中-小葉型和中-大葉型兩個(gè)類(lèi)群，而其他兩個(gè)分別為3份源自歐洲的大葉型類(lèi)群和5份源自歐洲的與10份源自亞洲的小葉型類(lèi)群。即原產(chǎn)地不同的多種材料聚為不同的類(lèi)群，表明白三葉形態(tài)變異與地理起源存在較密切的相關(guān)性，而少數(shù)分別起源于歐洲和亞洲的不同白三葉種質(zhì)亦聚為相同的一類(lèi)，從形態(tài)上看，屬于一個(gè)葉片最小的類(lèi)群，且3份源自歐洲的葉片最大的材料單獨(dú)聚為一類(lèi)。表明不同起源的白三葉亦出現(xiàn)相似的遺傳分化，原產(chǎn)歐洲的白三葉形態(tài)朝不同方向的進(jìn)化趨勢(shì)明顯，可能與歐洲為白三葉起源中心，遺傳多樣性豐富有關(guān)。Widdup等［3］報(bào)道，由于各種選擇壓力，如夏季的高溫、病毒病害、蟲(chóng)害以及基因漸滲，北美白三葉種質(zhì)資源葉片具有朝小葉和中葉進(jìn)化的趨勢(shì)。Gustine等［19］研究亦顯示，白三葉葉片大小變異很大，溫和的選擇壓力可能使他們朝不同的方向發(fā)展。

近年來(lái)，白三葉在我國(guó)作為牧草、生態(tài)草、園林植物等栽培應(yīng)用增長(zhǎng)迅速。然而，我國(guó)生產(chǎn)中應(yīng)用的白三葉品種主要從國(guó)外進(jìn)口，多數(shù)表現(xiàn)為對(duì)干旱、高溫的適應(yīng)性差，病蟲(chóng)害嚴(yán)重，因而產(chǎn)量低、持久性差，阻礙了白三葉生產(chǎn)潛力的發(fā)揮。大量研究表明，不同生境的白三葉種質(zhì)具豐富的形態(tài)變異以及多樣化的生長(zhǎng)和適應(yīng)環(huán)境的特性［20-27］，且不同地理起源的白三葉種質(zhì)保持著豐富的分子遺傳變異［28-32］。由此可見(jiàn)，在更廣泛的范圍內(nèi)，不同生境條件下收集不同生態(tài)型的白三葉種質(zhì)尤其是本土的種質(zhì)，以選育和改良優(yōu)良白三葉品種，滿(mǎn)足不斷增長(zhǎng)的多元化生產(chǎn)需求具有重要意義。

［1］Voisey C R，White D W R，Wigley P J，etal.Release of transgenic white clover plants expressingBacillus thuringiensisgenes：An ecological perspective［J］.Biocontrol Science and Technology，1994，4：475-481.

［2］Caradus J R，F(xiàn)orde M B，Wewala S，etal.Description and classification of a white clover（TrifoliumrepensL.）germplasm collection from southwest Europe［J］.New Zealand Journal of Agricultural Research，1990，33：367-375.

［3］Widdup K H，Caradus J R，Green J，etal.White clover ecotype germplasm from the USA for development of New Zealand and overseas cultivars Grassland［J］.Research and Practice Series，1996，6：149-154.

［4］Dzene I，Jansons A，Jansone B，etal.The study of variability of agro-morphological characteristics of white clover accessions from other countries in Latvian climate conditions［J］.Agronomy Research（Special Issue III），2010，8：537-544.

［5］Gustine D L，Huff D R.Genetic variation within and among white clover populations from managed permanent pastures of the northeastern U.S［J］.Crop Science，1999，39：524-530.

［6］Jahufer M Z Z，Cooper M，Harch B D.Pattern analysis of the diversity of morphological plant attributes and herbage yield in a world collection of white clover（TrifoliumrepensL.）germplasm characterised in a summer moisture stress environment of Australia［J］.Genetic Resources and Crop Evolution，1997，44：289-300.

［7］Paolo A，Rosemary P C，F(xiàn)lavio F，etal.Variation in cold tolerance and spring growth among Italian white clover populations［J］.Euphytica，2001，122：407-416.

［8］Negri V，Veronesi F.Possible role of natural populations of white clover for reclamation purposes in subhumid and humid Mediterranean environments［J］.Agronomie，1987，7：703-708.

［9］Finne M A，Rognli O A，Schjelderup I.Genetic variation in a Norwegian germplasm collection of white clover（TrifoliumrepensL.）［J］.Euphytica，2000，112：33-44.

［10］安曉珂.三葉草屬三種植物遺傳多樣性的RAPD分析［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，2008.

［11］何俊.62份白三葉種質(zhì)資源遺傳多樣性初步研究與評(píng)價(jià)［D］.貴州：貴州農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［12］吳海濤.俄羅斯引進(jìn)野生白三葉種質(zhì)資源的價(jià)值評(píng)價(jià)［D］.江蘇：揚(yáng)州大學(xué)，2009.

［13］Xian Z，Ying J Z，Rong Y，etal.Genetic variation of white clover（TrifoliumrepensL.）collections from China detected by morphological traits，RAPD and SSR African［J］.Journal of Biotechnology，2010，9（21）：3032-3041.

［14］切彩，李衛(wèi)軍，朱昊.11份白三葉材料的形態(tài)特征及生長(zhǎng)表現(xiàn)［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，47（1）：135-140.

［15］張婧源，彭燕，羅燕，等.不同產(chǎn)地白三葉種質(zhì)遺傳多樣性 的 SRAP 分 析 ［J］.草 業(yè) 學(xué) 報(bào)，2010，19（5）：130-138.

［16］Lane L A，Ayres J F，Lovett J V.A review of the introduction and use of white clover（TrifoliumrepensL.）in Australia-significance for breeding objects［J］.Australia Journal of Experimental Agriculture，1997，37：831-839.

［17］Caradus J R，MacKay A C，Woodfield D R，etal.Classification of a world collection of white clover cultivars［J］.Euphytica，1989，42：183-196.

［18］Davies W E，Young N R.The characteristica of European，Mediterranean and other populations of white clover（TrifoliumrepensL.）［J］.Euphytica，1967，16：330-340.

［19］Gustine D L，Voigt E C，Brummer P W，etal.Genetic variation of RAPD markers for North American white clover collections and cultivars［J］.Crop Science，2002，42（2）：343-347.

［20］Campbell B D，Caradus J R，Hunt C L.Temperature responses and nuclear DNA amounts of seven white clover populations which differ in early spring growth rates［J］.New Zealand Journal of Agricultural Research，1999，42：9-17.

［21］Fraser J.Characteristics of naturalized populations of white clover（Trifoliumrepens）in Atlantic Canada［J］.Canadian Journal of Botany，1989，67：2297-2301.

［22］Caradus J R，Christie B R.Winter hardiness and artificial frost tolerance of white clover ecotypes and selected breeding lines［J］.Canadian Journal of Plant Science，1998，78：251-255.

［23］Van D B J，Black I K，Cousins G R，etal.Enhanced drought tolerance in white clover［J］.Proceedings of the New Zealand Gmssland Association，1993，55：97-101.

［24］Jahufer M Z Z，Cooper M，Lane L A.Variation among low rainfall white clover（TrifoliumrepensL.）accessions for morphological attributes and herbage yield［J］.Australian Journal of Experimental Agriculture，1995，35：1109-1116.

［25］Jahufer M Z Z，Cooper M，Brien L A.Genotypic variation for stolon and other morphological attributes of white clover（TrifoliumrepensL.）populations and their influence on herbage yield in the summer rainfall region of New South Wales［J］.Australian Journal of Agricultural Research，1994，45（3）：703-720.

［26］Lane L A，Ayres J F，Lovett J V，etal.Morphological characteristics and agronomic merit of white clover（TrifoliumrepensL.）poulations collected from northern New South Wales［J］.Australian Journal of Agricultural Research，2000，51：985-997.

［27］Caradus J R，Hay R J M，Woodfield D R.The positioning of white clover cultivars in New Zealand［J］.Grassland Research and Practice Series，1996，6：45-50.

［28］Jahufer M Z Z，Barrett B A，Griffith G S，etal.DNA fingerprinting and genetic relationships among white clover cultivars［J］.Proceedings of New Zealand Grassland Association，2003，65：163-169.

［29］K?lliker R，Jones E S，Jahufer M Z Z，etal.Bulked AFLP analysis for the assessment of genetic diversity in white clover（TrifoliumrepensL.）［J］.Euphytica，2001，121：305-315.

［30］K?lliker R，Jones E S，Drayton M C，etal.Development and characterisation of simple sequence repeat（SSR）markers for white clover（TrifoliumrepensL.）［J］.Theoretical and Applied Genetics，2001，102：416-424.

［31］George J M P，Dobrowolski E Z，Jong N O，etal.Assessment of genetic diversity in cultivars of white clover（TrifoliumrepenseL.）detected by SSR polymorphisms［J］.Genome，2006，49：919-930.

［32］Fernanda B，Miguel D A，Maria T S W.Molecular characterization of the USDA white clover（TrifoliumrepensL.）core collection by RAPD markers［J］.Genetic Resources and Crop Evolution，2006，53：1081-1087.