瘦肉精三合一膠體金快速檢測(cè)板的研制及在畜肉中的應(yīng)用

王 森，周亞蓮，盛慧萍，桑麗雅，馬秋玲，楊光瑞，周建昌

(1.浙江省紹興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 紹興 312000;2.杭州南開日新生物技術(shù)有限公司，浙江杭州 310022)

瘦肉精是一類 β-腎上腺受體激動(dòng)劑，β-腎上腺素受體激動(dòng)劑 (簡(jiǎn)稱β-興奮劑)是具有苯乙醇胺結(jié)構(gòu)的一類物質(zhì)，可分為含取代基的苯胺型(如鹽酸克倫特羅)、苯酚型 (如沙丁胺醇)、苯二酚型 (如特布他林)三大類，主要包括鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺以及沙丁胺醇、溴布特羅、溴氯布特羅、馬布特羅等［1］。

β-受體激動(dòng)劑早期主要用于防治人、動(dòng)物支氣管哮喘和支氣管痙攣，后來研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加這類藥物具有營養(yǎng)再分配作用，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和改善動(dòng)物胴體結(jié)構(gòu)，提高瘦肉率的作用，因此，該類藥物曾被作為一種藥物促生長(zhǎng)添加劑被廣泛用于動(dòng)物生產(chǎn)［2］。但是人們食用了殘留有這些藥物的畜肉產(chǎn)品后會(huì)出現(xiàn)面色潮紅、頭痛、頭暈、胸悶、心悸、四肢麻木等不良反應(yīng)癥狀，嚴(yán)重的可能危及生命［3-4］。因此，歐盟、美國等都先后立法禁止在畜禽生產(chǎn)上使用該類藥物，我國農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)(2002)規(guī)定嚴(yán)禁在畜牧生產(chǎn)上使用各種β-興奮劑類藥物［5］。

目前，國內(nèi)外動(dòng)物性食品中β-受體激動(dòng)劑在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的檢測(cè)方法主要是氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)［6-7］，GC-MS 作為確證方法具有靈敏度高、精確性好的優(yōu)點(diǎn)，但操作煩瑣、成本高。瘦肉精膠體金快檢卡是當(dāng)前β-興奮劑類檢測(cè)最主流的現(xiàn)場(chǎng)快速篩選方法，市場(chǎng)占有率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA法)，以檢測(cè)尿液為主，但尿樣檢測(cè)存在弊端。相對(duì)來說，檢測(cè)畜肉組織中β-興奮劑殘留量更為穩(wěn)定和準(zhǔn)確。本研究研制了一種檢測(cè)畜肉組織中3種瘦肉精殘留的膠體金快速檢測(cè)板。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

鹽酸克倫特羅 (CLEN)、萊克多巴胺(RAC)、沙丁胺醇 (SAL)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白 (OVA)、氯金酸 (HAuCl4·4H2O)、羊抗鼠IgG均購自美國 Sigma公司;聚乙二醇20000購自華東醫(yī)藥有限公司;硝酸纖維素膜、膠體金結(jié)合墊、樣品墊均購于Millipore公司;抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體、抗萊克多巴胺單克隆抗體、抗沙丁胺醇單克隆抗體均由杭州南開日新生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2 儀器

Avanti J-26XP高速冷凍離心機(jī) (美國 Becman公司)、UV-2802紫外連續(xù)掃描分光光度計(jì) (美國UNICO公司)、78HW-1恒溫磁力攪拌器 (杭州儀表電機(jī)有限公司)、恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、BioJet XYZ3000型點(diǎn)膜儀 (美國BioDot公司)、切割機(jī) (杭州市恒通設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 特異性結(jié)合抗原的制備及鑒定

鹽酸克倫特羅特異性結(jié)合抗原的制備采用重氮法。稱取100 mg BSA，用10 mL 0.1 mol·L-1pH值10.0的碳酸鈉緩沖溶液溶解，得到溶液A。另外稱取20mg鹽酸克倫特羅，用2mL 0.5 mol·L-1的硫酸溶液溶解，混勻后加入300 μL 10 mg· mL-1的亞硝酸鈉，持續(xù)反應(yīng)2 h，得到溶液B。在攪拌下，將溶液B逐滴加入溶液A中，混勻后，置于4℃下避光反應(yīng)5 h(期間可顛倒混勻)，之后用0.01 mol·L-1pH值7.4的 PBS緩沖液透析4 d，期間每間隔8 h換液1次。再將溶液離心，收集上清液，-20℃下凍存?zhèn)溆谩?/p>

萊克多巴胺特異性結(jié)合抗原的制備采用混合酸酐法。34 mg鹽酸萊克多巴胺溶于2 mL吡啶，加入12 mg戊二酸酐;室溫下攪拌過夜;氮?dú)獯蹈蛇拎?0.1 mmol·L-1萊克多巴胺半抗原溶解到4 mL DMF N'N-二甲基甲酰胺 ∶1，4-二氧六環(huán) (V∶V為1∶1)，添加26.2 μL三正丁胺;上述混合物冰浴攪拌10 min，加入14.3 μL氯甲酸異丁酯，恢復(fù)到室溫，攪拌反應(yīng)1 h;上述混合物逐滴加入到預(yù)冷BSA溶液中 (100 mg BSA溶于pH值8.5 0.1 mol·L-1硼酸鈉溶液)，混合物恢復(fù)到室溫，攪拌過夜;用0.01 mol·L-1pH值7.4的 PBS緩沖液透析3 d，每天換液3次。

沙丁胺醇特異性結(jié)合抗原的制備采用混合酸酐法。稱取240 mg沙丁胺醇?jí)A，用20 mL甲醇溶解;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)為黃色油狀物;再用無水乙醇溶解，逐滴加入乙醇溶解的120 mg丁二酸酐;氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，室溫?cái)嚢? h;將反應(yīng)液離心，棄上清液;用無水乙醇洗滌沉淀物3次;揮干溶劑所得白色固體即半抗原沙丁胺醇半琥珀酸。

稱40 mg半琥珀酰沙丁胺醇，溶于1，4-二氧六環(huán)-水-三乙胺的混合物中;攪拌下逐滴加入30 μL氯甲酸異丁酯 (30 min內(nèi));將上述反應(yīng)液逐滴加入到25 mL含80 mg BSA的蒸餾水中;4℃反應(yīng)過夜;0.01 mol·L-1pH值7.4的PBS緩沖液透析3 d，每天換液3次。

抗原的鑒定。合成的鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇特異性結(jié)合抗原稀釋成 100 μg·mL-1(蛋白濃度)后做200～400 nm波長(zhǎng)的紫外掃描。比較半抗原、載體蛋白和偶聯(lián)物的紫外光譜圖，判斷偶聯(lián)是否成功。

1.2.2 抗體-膠體金標(biāo)記物的制備

膠體金溶液的制備。采用檸檬酸三鈉法［8］，制備粒徑為30 nm左右的膠體金溶液。

標(biāo)記前分別將抗鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇單克隆抗體溶液以1 5 000 r·min-14℃離心30 min，取上清液;取已制備好的膠體金溶液100 mL，用 0.1 mol·L-1K2CO3和 0.1 mol·L-1HCl將膠體金溶液的pH值調(diào)至8.0～8.2。邊攪拌邊分別加入最適量的單克隆抗體，加入蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)逐滴加入，1 mg的蛋白質(zhì)大約5 min加完;在攪拌下加入5%的BSA使其終濃度為1%，或加入3%聚乙二醇 (PEG MW 20 000)使其終濃度為0.05%;12 000 r·min-1離心 25 min，棄上清液;加入10 mL 0.01 mol·L-1pH值 7.4的 PBS緩沖液 (含 0.4 mol·L-1PEG 20 000)，12 000 r·min-1下離心25 min，棄上清液，如此洗滌 2～4次，以徹底除去未結(jié)合的蛋白質(zhì);將沉淀用10 mL含2% BSA的 PBS緩沖液 (pH值7.4，0.01 mol·L-1)溶解;用0.22 μm無菌過濾器過濾后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 檢測(cè)板大卡的組裝

檢測(cè)線、控制線及膠體金結(jié)合墊的包被。

用點(diǎn)膜機(jī)把適當(dāng)質(zhì)量濃度的特異性結(jié)合抗原(CLEN-BSA、RAC-BSA、SAL-BSA)、羊抗鼠 IgG噴在硝酸纖維素膜 (NC膜)上，分別作為檢測(cè)線(T線)和控制線 (C線)。

將制備好的金標(biāo)記單克隆抗體用點(diǎn)膜機(jī)噴到玻璃纖維素膜上，作為膠體金結(jié)合墊。

特異性結(jié)合抗原、羊抗鼠IgG和金標(biāo)抗體包被量的選擇方法。在 T線粗調(diào)范圍0.6～1.0 mg·L-1內(nèi)和C線粗調(diào)范圍0.6～1.5 mg·L-1內(nèi)，選擇一組質(zhì)量濃度，按常規(guī)噴量0.8～1.0 μL·cm-1包被到NC膜上，60℃干燥箱放置2 h。將制備好的金標(biāo)記抗體溶液選擇不同包被量(1.0～2.0 μL·cm-1)包被到玻璃纖維素膜上，33℃烘箱干燥12 h。

檢測(cè)板各組分的組裝。將樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊用不干膠依次粘貼在底板上組裝成大卡 (圖1)。

1.2.4 檢測(cè)板各組分的優(yōu)化

圖1 檢測(cè)板的結(jié)構(gòu)組成

用切割機(jī)將組裝好的大卡切割成4 mm寬的試紙條，裝入塑料模板中組裝成三合一檢測(cè)檢測(cè)板(圖 2)。

用 0.01 mol·L-1、pH 值 7.4的磷酸鹽(PBS)緩沖液和含1.0 μg·L-1鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各取100 μL分別進(jìn)行試紙條滴定，觀察顯色變化和試紙條靈敏度，反復(fù)調(diào)試，最終選擇顯色深淺適中、靈敏度最高、梯度最大的一組特異性結(jié)合抗原、羊抗鼠IgG和金標(biāo)抗體質(zhì)量濃度作為最終配比。

圖2 鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇膠體金快速檢測(cè)檢測(cè)板

1.2.5 樣品前處理

樣品粗提處理。稱取4 g左右剪碎的畜禽肉樣本裝于5 mL刻度冷凍管中，蓋緊管蓋，于90℃以上水浴鍋中煮10 min;冷卻至常溫后，取3滴煮出的溶液 (盡量吸取肉汁中上清)于1.5 mL離心管中，再加入3滴CLEN專用PBST緩沖液，充分混合，待檢。L樣品精提處理。取去脂肪組織樣本于均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)1 min(10 000 r·min-1);稱取2.5 g均質(zhì)物于15 mL離心管中，加入5 mL 0.1 mol·L-1HCl，振蕩混勻 10 min;加入 100 μL 4 mol·L-1NaOH，劇烈振蕩30 s后，室溫下4 000 r·min-1離心15 min;轉(zhuǎn)移全部上清于15 mL離心管中，加入 50 μL 4 mol·L-1NaOH，振蕩混勻，再加入8 mL乙酸乙酯，振蕩5 min;取上層有機(jī)相6 mL于試管中，65℃氮 (空)氣吹干;向吹干的試管中依次加入0.3 mL正己烷和0.3 mL RAC專用PBST緩沖液，充分溶解試管壁上殘留物，靜置分層后，吸取至少100 μL下層溶液檢測(cè)。

1.2.6 檢測(cè)步驟及結(jié)果判斷

用滴管吸取待檢樣品，垂直滴加3滴 (約100 μL)于每個(gè)加樣孔中，加樣后開始計(jì)時(shí);結(jié)果應(yīng)在3～5 min讀取，其他時(shí)間判讀無效。

肉眼觀察樣品檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)線 (T線)顯色比控制線 (C線)深或一樣深為陰性 (表明樣品中對(duì)應(yīng)待檢藥物濃度低于檢出限，或不含待檢藥物，圖3中a);檢測(cè)線 (T線)比控制線 (C線)淺，或檢測(cè)線 (T線)無顯色為陽性 (表明樣品中對(duì)應(yīng)待檢藥物大于等于檢出限，圖3中b)。未出現(xiàn)C線，見圖3中c，可能是操作不當(dāng)或檢測(cè)板已失效，應(yīng)重新進(jìn)行測(cè)定。

圖3 免疫膠體金快速檢測(cè)檢測(cè)板結(jié)果的判斷

1.2.7 檢出限測(cè)定

取經(jīng) LC-MS/MS法［9］確證的陰性畜禽肉樣品，分別添加CLEN、RAC、SAL標(biāo)準(zhǔn)品溶液制成含量為0，3.0，5.0，8.0 和10.0 μg·kg-1的樣品各10個(gè)，樣品通過粗提處理和精提處理后用本研究制備的三合一檢測(cè)板進(jìn)行測(cè)定，確定檢出限。

1.2.8 與儀器方法的比對(duì)

隨機(jī)取10份畜禽肉樣品，作為供試試樣。每份樣品分別用LC-MS/MS法和本研究制備的瘦肉精三合一快速檢測(cè)板進(jìn)行檢測(cè)，比較檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性結(jié)合抗原的鑒定

鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇特異性結(jié)合抗原的紫外掃描圖譜 (圖4)。通過圖譜可以看出，偶聯(lián)后的 CLEN-BSA、RAC-BSA、SAL-BSA的特征吸收波峰均發(fā)生偏移，根據(jù)吸光度加合性原理，表明偶聯(lián)成功。

圖4 紫外掃描的圖譜

2.2 檢出限

CLEN、RAC、SAL含量為 0，3.0，5.0，8.0和10.0 μg·kg-1的樣品通過粗提處理后，用瘦肉精三合一膠體金快速檢測(cè)板進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果含量為0和3.0 μg·kg-1的樣品檢測(cè)結(jié)果均為陰性，含量為5.0，8.0和10.0 μg·kg-1的樣品檢測(cè)結(jié)果均為陽性，故該檢測(cè)板對(duì)畜禽肉樣品中 CLEN、RAC、SAL的檢測(cè)限為5.0 μg·kg-1(簡(jiǎn)單前處理)。檢測(cè)板檢測(cè)顯色結(jié)果見圖5。CLEN、RAC、SAL含量為 0，0.5，1.0和 2.0 μg·kg-1的樣品通過精提處理后，用檢測(cè)板進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果含量為0和0.5 μg·kg-1的樣品檢測(cè)結(jié)果均為陰性，含量為1.0和2.0 μg·kg-1的樣品檢測(cè)結(jié)果均為陽性，故該檢測(cè)板對(duì)畜禽肉樣品中CLEN、RAC、SAL的檢測(cè)限為 1.0 μg·kg-1(復(fù)雜前處理)。檢測(cè)板檢測(cè)顯色結(jié)果見圖6。

圖5 檢測(cè)板檢測(cè)0～10.0 μg·kg-1樣品的顯色結(jié)果

2.3 與儀器方法的比對(duì)

10份畜禽肉盲樣經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，其中，5份樣品未檢出瘦肉精殘留，另5份樣品分別檢出陽性 (樣品 S-1:CLEN 2.81 μg·kg-1，樣品 S-3:CLEN 1.01 μg·kg-1、RAC 1.32 μg·kg-1、 SAL 2.97 μg·kg-1， 樣 品 S-5:RAC 2.35 μg·kg-1、SAL 1.43 μg·kg-1，樣品 S-8:RAC 3.13 μg·kg-1， 樣 品 S-10:SAL 4.62 μg·kg-1)。這些樣品同時(shí)用瘦肉精三合一膠體金快速檢測(cè)板檢測(cè) (復(fù)雜前處理)，結(jié)果與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)結(jié)果完全符合 (表1)。

圖6 檢測(cè)板檢測(cè)0～2.0 μg·kg-1樣品的顯色結(jié)果

表1 膠體金快速檢測(cè)板與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)結(jié)果的比較

3 小結(jié)和討論

影響膠體金檢測(cè)檢測(cè)板質(zhì)量的因素較多，除特異性結(jié)合抗原、特異性抗體的特性外，還包括膠體金顆粒大小、抗原抗體包被量配比等。

膠體金顆粒制備好壞非常重要。如果金顆粒太小就不能產(chǎn)生足夠的顏色信號(hào)，導(dǎo)致目測(cè)效果較差;如果太大在標(biāo)記時(shí)又會(huì)遇到空間位阻的問題。本試驗(yàn)選用了直徑為30 nm左右的膠體金。

特異性結(jié)合抗原、羊抗鼠IgG和金標(biāo)抗體包被量是決定檢測(cè)板靈敏度的3個(gè)主要變量。T線上特異性結(jié)合抗原包被量過小，顯色太淡，會(huì)影響視覺效果，反之包被量過大，雖然顯色深，但是靈敏度會(huì)降低。金標(biāo)抗體的標(biāo)記量由抗體特性決定，調(diào)試變量是其包被量。包被量的選擇依據(jù)一是顯色深淺，二是靈敏度高低，需反復(fù)調(diào)試確定最佳配比。

組織中克倫特羅等瘦肉精殘留主要是螯合物的形式存在，在堿性條件下利于提取。但是抗原抗體反應(yīng)需要在近中性的條件下進(jìn)行，所以樣品墊緩沖體系的調(diào)節(jié)作用至關(guān)重要，如果太偏堿，則跑板速度變慢導(dǎo)致顯色偏淺。如果太偏酸，會(huì)導(dǎo)致主要依靠靜電結(jié)合的抗體與金顆粒分離，造成檢測(cè)線和控制線不顯色或顯色淺，易造成假陽性和假陰性。

本研究制備的瘦肉精三合一膠體金快速檢測(cè)檢測(cè)板，一次樣品前處理可以同時(shí)檢測(cè)畜禽肉中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇3種瘦肉精藥物，檢出限低，準(zhǔn)確率高，且操作簡(jiǎn)單快速，特別適合廣大基層部門對(duì)畜禽樣品進(jìn)行大規(guī)模篩選。

［1］ 孫雷，劉琪，張?bào)P，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)豬尿中β-受體激動(dòng)劑殘留的研究 ［J］.中國獸藥雜志，2008，42(4):15-18.

［2］ Mersmann H J.Overview of the effects of β-adrenergic receptor agonist on animal growth including mechanism of action ［J］.J Anim Sci，1998，76(1):160-172.

［3］ 張改平，王選年，肖肖.瘦肉精的毒害作用及其試紙快速檢測(cè)技術(shù) ［J］.中國動(dòng)物檢疫，2011，28(5):1-6.

［4］ 沈建忠，汪海洋.畜產(chǎn)品中 β-受體激動(dòng)劑殘留及其危害［J］.中國動(dòng)物檢疫，28(6):27-28.

［5］ 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.動(dòng)物食品中獸藥最高殘留限量:第235號(hào)公告［S］.2002-12-24.

［6］ 蔣萬楓，董詩竹，李鈺.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物組織中6種β-受體激動(dòng)劑殘留量研究 ［J］.農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)科學(xué)，2012(3):33-34.

［7］ 孔瑩，邱月明，李鵬，等.固相萃取/氣相色譜-質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定豬肉中4種β-激動(dòng)劑類藥物殘留 ［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2006，25(2):63-66.

［8］ 檀尊社，陸恒，邵偉，等.膠體金免疫層析法快速檢測(cè)水產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物殘留 ［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，19(8):32-37.

［9］ 農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告:18-2008動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 ［S］.