二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）基因在煙草中的過量表達

黃春國，馬素嫻

（1.山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學園藝學院，山西太谷030801）

在影響植物花色的各種因素中，花色素具有非常重要的作用。近年來，世界各國的學者對花色素作為影響花色的主要可調控因素這一研究課題投入了極大的關注。而花色素主要由3 種不同的花色苷構成，分別為甜菜紅色素（Betalains）、類胡蘿卜素（Carotenoids） 和花青素（Anthocyanins）[1]。因此，進一步研究花色素形成機理顯得越來越重要，尤其是對花色素生物合成途徑中各種有關酶的研究更是具有很重要的意義[2-4]。

二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）屬于NADPH依賴性短鏈還原酶家族，具有專門的NADPH 結合域，在花色素苷生物合成過程中起著非常關鍵的作用。其最早發(fā)現(xiàn)于紫羅蘭的一個突變體中，它在花色的修飾中起著很重要的作用，是花青素合成途徑中的關鍵酶。在花色素苷生物合成代謝途徑中，其主要作用就是將3 種二氫黃酮醇化合物（DHQ，DHK，DHM）還原成無色的花色素苷（Leucoanthocyanidin），并作為下一步驟中花色素苷合成酶（ANS）和類黃酮3-O-糖基轉移酶（3GT）催化的底物，再進一步催化形成穩(wěn)定的花色素苷，從而使植株花器官呈現(xiàn)出各種顏色[4-6]。

煙草（Nicotiana tabacum）為茄科（Solanaceae）煙草屬（Nicotianacco）1 a 生草本植物，在我國南北均有種植，是我國一種重要的經(jīng)濟作物[7-8]，也是我國國民經(jīng)濟收入的一個重要支撐。本研究采用植物轉基因技術，將從野生型煙草中分離和克隆得到的NtDfr1，NtDfr2 基因，通過根癌農(nóng)桿菌方法轉入到栽培品種煙草中，得到陽性抗性植株后，收獲種子并進行播種，最后對得到的轉基因煙草植株中二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）進行分析研究，為探索花色素合成途徑提供重要參考。

1 材料和方法

1.1 植物材料

試驗所用野生型煙草品種為N. tobacco（SNN），N. sylvestins（N. s）和N. tomentosifornis（N.t），獲得的轉基因煙草品種分別為：dfr1-2，dfr1-5，dfr1-11 和dfr2-1，dfr2-2，dfr2-3。品種均由美國肯塔基大學煙草研究中心植物與土壤科學系重點實驗室提供。

1.2 宿主菌

試驗使用的大腸桿菌（Escherichia coli）TB1由美國肯塔基大學煙草研究中心植物與土壤科學系重點實驗室提供。

1.3 質粒載體

試驗所使用的質粒載體為：PGEM-T easy vector，PCAMBIA-2300 vector，PKYLX80 vector 和PCAMBIA-2301 vector。

1.4 PCR 引物

（1）35 S 啟動子引物序列（500 bp）P1：CTT AC GCAGC AGGTC TCATC A；P2 CCACC TTCCT TTTCC ACTAT CTT。（2）煙草DFR 基因引物序列（full-length cDNA） F: 5′-GGC AGA TCT ATG GCA AGT GAA GCT CAT GCA-3′；R: 5′-ATG TCT AGA CTA GAT TTC CCC ATT GGT TGA-3′。（3）煙草DFR1 基因引物序列F：5′-AAC CAA CAG TCA GGG GAA TG-3′；R：5′-TTG GAC ATC GAC AGTTCC AG-3′。（4）煙草DFR2 基因引物序列F：5′-AAC CAA CAG TCA GGG GAA TG-3′；R：5′-TTG GGC ATC GAG AGT TCC AG-3′。（5）KAN 引物序列F：5′-ATG GGG ATT GAA CAA GAT GGA-3′；R：5′-TCA GAA GAA CTC GTC AAG AAG-3′。（6）GAPDH 引物序列F：5′-GGT GTC CAC AGA CTT CGT GG-3′；R：5′-GAC TCC TCA CAG CAG CAC CA-3′。

1.5 試驗方法

采用SDS 法提取樣本的總DNA 和總RNA[9]。利用Primer 3 軟件設計引物，由Invitrogen 公司合成寡核苷酸片段。使用引物時可將公司合成的引物離心2 min 后，用10 mmol/L Tris-HCl 稀釋為100 μmol/L 的引物原液，離心混勻。再將引物原液稀釋為2.5 μmol/L 用于PCR 反應，離心后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結果與分析

2.1 野生型煙草中DFR 基因的鑒定

提取野生型煙草的基因組DNA 后，用設計好的引物對目的基因DFR 進行PCR 反應，然后進行瓊脂糖凝膠電泳技術檢測。從圖1 可以看出，野生型煙草中存在DFR 基因。同時還得知，DFR 基因為1 600 bp。

2.2 不同轉基因煙草品種中的DFR 基因表達分析

提取轉基因煙草（dfr1-5，dfr1-11 和dfr2-2）和野生型煙草（SNN）幼嫩葉片組織的總RNA后，反轉錄人工合成cDNA，后用DFR，DFR1，DFR2，KAN，GAP 序列引物，進行PCR 反應，然后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2 所示。

由圖2 可知，DFR 基因在dfr1-5，dfr1-11 和dfr2-2 轉基因煙草中的表達量基本一致，而在野生型煙草（SNN）中的表達量很少；DFR1 基因在dfr1-5 和dfr1-11 品種中超表達，在dfr2-2 品種中表達量明顯變少，但在野生型煙草（SNN）中幾乎不表達；DFR2 基因在dfr2-2 品種中超表達，而在dfr1-5 和dfr1-11 品種中表達量明顯下降，在野生型煙草（SNN）中微量表達，且條帶不太清晰。由此可知，通過轉基因技術將二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）目的基因轉入野生型煙草中，能極大地提高二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）基因在植物體內(nèi)的表達量，增加其在植物體內(nèi)的積累量，從而增強它的催化作用，促進花色素苷的生物合成。

2.3 不同轉基因品種與野生型品種DFR 基因表達的差異性分析

試驗結果顯示，轉基因獲得的煙草花色較深或為紅色，表明二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）基因得到了過量表達即超表達，符合試驗預期目的。

轉目的基因NtDfr1，NtDfr2 煙草中花器官的顏色與對照野生型煙草相比，明顯加深且變?yōu)榧t色，這主要是由于在轉基因煙草中二氫黃酮醇-4-還原酶得到了超表達而使花色素大量積累，但是轉目的基因NtDfr1，NtDfr2 煙草之間也存在一些差異性，而無法通過肉眼分辨，因此，選用轉目的基因dfr1-5，dfr1-11，dfr2-2，dfr2-3 這4 個轉基因煙草植株，使用了DFR1，DFR2 序列引物、煙草GAPDH 序列引物，運用實時定量PCR反應（QRT-PCR）的方法，對這4 個轉基因煙草植株的花器官中目的基因的表達量進行了分析，結果如圖3 所示。

由圖3 可知，轉目的基因NtDfr1，NtDfr2 煙草中的二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）表達量遠遠高于野生型煙草，在14～22 倍之間，但是它們之間也存在一定的差異性，如在dfr2-2 煙草植株中，DFR 基因的表達量是對照的22 倍，dfr1-5煙草植株中表達量次之，dfr2-3 煙草植株中最少；在它的花器官中，二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）表達量大約是野生型煙草的14 倍左右，這些差異性可能是由目的基因在整合、復制、轉錄和翻譯的過程中出現(xiàn)了一些變化而造成的，也可能是由外源基因與內(nèi)源基因之間存在的共抑制性造成的，還可能是由于周圍環(huán)境因素的影響而造成了它們之間的差異性。應加強利用外源基因的鑒定和遺傳分析的方法，逐步分析和找出造成這種差異性的具體原因，從而提高轉基因植物的轉化效率和對新物種的利用率。

3 結論與討論

植物花器官的顏色是決定其觀賞價值的一個重要因素，長期以來，人們主要是通過傳統(tǒng)育種的方式獲得一些新異的花色來滿足花卉市場的需求[6]。但由于傳統(tǒng)育種技術的局限性，近年來，諸多學者開始把轉基因技術引入花卉育種領域，極大地縮短了育種年限，減少了傳統(tǒng)育種技術中常常出現(xiàn)的各種不良性狀等因素的影響[10]。植物基因工程技術在改變花色應用中，既提高了育種效率，又可定向地修飾觀賞植物的特定性狀而不喪失其原有的其他性狀，因此，植物基因工程技術在花卉育種研究中得到了快速的發(fā)展[11-12]。

本試驗應用植物轉基因技術，從野生型煙草中克隆得到二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）基因，然后再轉入煙草中進行超表達，從而達到改變花色的目的。試驗結果顯示，轉基因煙草的花色明顯加深或變?yōu)榧t色；通過實時定量PCR 反應（QRT-PCR） 可知，二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）基因在轉基因植物中得到了超表達，為植物花色素苷合成代謝途徑的下一步反應提供了充足的反應底物，促進了花色素苷的生物合成，使植物的花色發(fā)生了改變。

本試驗中，將NtDfr1，NtDfr2 基因轉入煙草中，得到了轉基因煙草DFR1 和轉基因煙草DFR2 這2 個品種，在對這2 個品種進行分析時發(fā)現(xiàn)，它們之間也存在一定的差異性，二者中的二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）在體內(nèi)的表達量略有差異，但是從花器官的色彩和形態(tài)上幾乎沒有什么差別，只有在使用實時定量PCR 反應（QRT-PCR）法進行分析時，才能看到一些異同。另外，還觀察到轉基因煙草植株中有部分花色變淡或變?yōu)榘咨?，其他性狀也略有所改變，生長發(fā)育也較為遲緩，這可能是由于共抑制的作用，外源二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）基因的導入抑制或沉默了內(nèi)源二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）基因的順利表達和積累。

總之，本研究所得出的結論對實際生活能產(chǎn)生一定的作用，尤其是運用到花卉育種領域和生物制藥工程中，既能打破傳統(tǒng)育種技術的局限性、為培育各種新奇的花色提供必要的技術手段，又能提高植物體內(nèi)類黃酮類物質的積累量、為生物制藥工程提供大量的原料物質來源。

［1］Erich Grotewold. The genetics and biochemistry of floral pigments[J].Plant Biol，2006，57：761-800.

［2］Jeffrey B Harborne，Christine A Williams.Advances in flavonoid research since 1992[J].Phytochemistry，2000，55：481-504.

［3］ Joseph Mol，Erich Grotewold，RonaldKoes. How genes paint flowers and seeds[J].Plant Science，1998，3（6）：212-217.

［4］Quattrocchio F，Baudry A，Lepiniec L，et al. The regulation of flavonoid biosynthesis[M].NewYork：Springer，2006：97-122.

［5］Koes R，Verweij W，Quattrocchio F.Flavonoids:a colorful model for the regulation and evolution of biochemical pathways[J].Trends Plant Sci，2005，10：236-242.

［6］Gert Forkmann，Stefan Martens. Metabolic engineering and applications of flavonoids [J]. Elsevier Science Ltd，2001，12（2）：155-160.

［7］薛金愛，趙彥宏.煙草SSR 分布特征與開發(fā)利用[J].山西農(nóng)業(yè)科學，2011，39（4）：295-298，306.

［8］李玲玉.有機土壤對煙草葉片結構的影響[J].天津農(nóng)業(yè)科學，2011，17（5）：91-92.

［9］Forkmann G.Flavonoids as flower pigments:the formation of the natural spectrum and its extension by genetic engineering[J].Plant Breed，1991，106：1-26.

［10］曾海濤，王義琴，陳英，等.花卉花色基因工程的研究現(xiàn)狀及存在問題[J].中國生物工程雜志，2004，24（6）：54-57.

［11］Zhao Y P，Chen F D，Guo W M.Advances in genetic engineering of flower color of ornamental plants [J]. Chin Bull Bot，2003，20（1）：51-58.

［12］廉利，車代弟，李靜，等.花色基因工程研究進展[J].北方園藝，2004（4）：8-9.