植物硒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究進(jìn)展

馬建輝，孫梅好

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004）

硒（selenium，Se）是哺乳動(dòng)物、細(xì)菌等許多生物的必需微量元素[1-3]，適量補(bǔ)充硒有利于植物的生長(zhǎng)發(fā)育，可提高農(nóng)作物的產(chǎn)量及品質(zhì)[4-8]。硒在土壤中的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)大約為0.4 mg/kg，某些地區(qū)的硒含量超過(guò)10 mg/kg[9]，可能會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物以及人類硒中毒[10-12]。人體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)25 種硒蛋白（selenoprotein），例如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）、硫氧還蛋白還原酶（thioredoxin reductase，TrxR）、甲狀腺激素脫碘酶家族（thyroid hormone deiodinase families）等[13]。硒蛋白在生物體內(nèi)有抗氧化、清除體內(nèi)自由基的功能，硒的缺乏將會(huì)使癌癥、病毒感染以及男性不育的幾率增加[14-16]。硒的嚴(yán)重缺乏將會(huì)使動(dòng)物患上白肌病，使人類患上克山病[17-18]。

農(nóng)作物主要吸收轉(zhuǎn)化土壤中的硒酸鹽（selenate）和亞硒酸鹽（selenite），為人及哺乳動(dòng)物提供硒。不同植物的硒累積量具有很大差異，有的甚至可達(dá)到1 000 倍[19]，這可能是不同植物的硒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的選擇性及轉(zhuǎn)運(yùn)能力不同造成[20-21]。

在植物體內(nèi)，硒酸鹽主要是通過(guò)硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行吸收。而亞硒酸鹽的吸收比較復(fù)雜，有多種因素[22-27]可影響其在植物體內(nèi)的累積。最近研究發(fā)現(xiàn)，多種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了亞硒酸鹽的吸收累積，如硅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[28]、磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[23，29]和單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[30]等。本文主要對(duì)近幾年植物硒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究結(jié)果進(jìn)行總結(jié)，并對(duì)未來(lái)的研究方向進(jìn)行展望。

1 植物對(duì)硒的吸收

硒是非金屬元素，有4 種同素異形體：灰色單質(zhì)硒、紅色單質(zhì)硒、黑色單質(zhì)硒和無(wú)定形硒，其中，黑色單質(zhì)硒最為穩(wěn)定。在自然界中，硒主要以-2，0，＋4，＋6 等不同價(jià)態(tài)存在于有機(jī)和無(wú)機(jī)化合物中，其中，無(wú)機(jī)硒化合物主要是硒酸鹽和亞硒酸鹽，而有機(jī)硒形態(tài)較多，但參與蛋白質(zhì)合成的主要是硒代半胱氨酸（selenocysteine，SeCys）和硒代甲硫氨酸（selenomethionine，SeMet）。

1.1 硒酸鹽和亞硒酸鹽在環(huán)境中的分布

在不同土壤條件下，硒酸鹽和亞硒酸鹽的分布不同。在氧氣比較充足、土壤比較干燥的堿性環(huán)境（（pe＋pH）＞15）中，硒酸鹽的含量較多；在潮濕、缺氧的酸性到中性土壤（7.5＜（pe＋pH）＜15）中，亞硒酸鹽的含量較多；在其他還原性較強(qiáng)的土壤（（pe＋pH）＜7.5）中，硒化物（selenide）占主要地位[26，31]。植物吸收少量的有機(jī)硒化物[32]，主要是通過(guò)不同的吸收機(jī)制吸收土壤中的硒酸鹽和亞硒酸鹽。

1.2 硒酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

硒和硫是同一主族元素，硒酸鹽和硫酸鹽物理化學(xué)性質(zhì)相似[33]，高濃度硫酸鹽在一定程度上抑制硒酸鹽的吸收[34]，硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的突變可影響細(xì)胞對(duì)硒酸鹽的耐受能力[35-36]，表明硒酸鹽可通過(guò)硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

根據(jù)硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼序列的同源性、動(dòng)力學(xué)特性及組織和細(xì)胞定位的不同，硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可分為5 大類[37]。第I 類是高親和性的硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（硫酸鹽Km為1.5～10 μmol/L），如在擬南芥根部大量表達(dá)的AtSultr1；2 和AtSultr1；1[38]，通常在韌皮部表達(dá)的AtSultr1；3[39]。第II類大部分是低親和性的硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（硫酸鹽Km值大于100 μmol/L），如在根、葉微管組織中表達(dá)較多的AtSultr2；1，根韌皮部及葉維管束鞘細(xì)胞表達(dá)的AtSultr2；2[40-41]。第III 類在種皮、胚中表達(dá)，且其表達(dá)不受培養(yǎng)介質(zhì)中硫酸鹽含量的影響[40]。第IV 類參與調(diào)節(jié)胞內(nèi)硫酸鹽濃度[42]。推測(cè)第V 類可能參與液泡硫酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)[37]，但尚未得到證實(shí)。

第I 類硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)硫酸鹽的高親和性、在根系中大量表達(dá)以及受硫酸鹽的表達(dá)調(diào)控[37]，表明其在植物吸收硫酸鹽的過(guò)程中具有重要作用。為研究此類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是否也在硒酸鹽吸收過(guò)程中發(fā)揮同樣的功能，利用不同的擬南芥耐硒突變體sel1-11，sel1-12，sel1-13，sel1-14 發(fā)現(xiàn)第I 類硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtSultr1；2 編碼區(qū)的突變或者啟動(dòng)子突變均可提高其耐硒能力[36，43-44]。

AtSultr1；1 與AtSultr1；2 在吸收硫酸鹽過(guò)程中具有相同的功能，但AtSultr1；2 突變影響硒酸鹽吸收能力，而AtSultr1；1 突變不影響其吸收[36]，說(shuō)明AtSultr1；2 為硒酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。紫云英屬高累積硒植物，莖部的硒含量可達(dá)干質(zhì)量的0.6%，比非累積植物高100～1 000 倍[19]，這可能是由于不同植物的硒酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的選擇性及轉(zhuǎn)運(yùn)能力不同造成的[20]。

1.3 亞硒酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

亞硒酸為弱酸，其pKa1和pKa2分別為2.57和6.60[28]。亞硒酸鹽在pH 值低于2.5 的環(huán)境中主要為H2SeO3/SeO2；在pH 值為2.5～6.6 的環(huán)境中主要為HSeO3-，在pH 值大于6.6 的環(huán)境中主要為SeO32-[28]。因其解離狀況的不同，植物根系細(xì)胞對(duì)不同形態(tài)的+4 價(jià)態(tài)硒化合物的吸收能力可能不同。研究表明，水稻幼苗根在不同pH 值條件下對(duì)亞硒酸鹽可能具有不同的吸收機(jī)制[26]。結(jié)果顯示，pH 值為3.0，8.0 時(shí)，DNP 和低溫（4 ℃）對(duì)水稻根系吸收硒的能力僅有較小程度抑制；而pH 值為5.0 時(shí)，DNP 和低溫能夠抑制大部分亞硒酸鹽的吸收。進(jìn)一步分析表明，在pH 值為3.0的條件下，亞硒酸鹽可能主要是通過(guò)水孔蛋白被動(dòng)進(jìn)入根細(xì)胞；而在pH 值為5.0 的條件下，主要以主動(dòng)方式進(jìn)入根細(xì)胞[26]。

最近，Zhao 等[28]發(fā)現(xiàn)，屬于水孔蛋白家族的水稻硅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Lsi1（OsNIP2；1）可作為亞硒酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮功能（圖1）。lsi1 水稻突變株與野生株相比，地上部分和木質(zhì)部汁液中硒濃度明顯降低，而硫酸鹽的吸收不受影響；lsi2 突變株與野生株相比，亞硒酸鹽的吸收能力幾乎不受影響，表明水稻硅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Lsi1 參與了亞硒酸鹽的吸收，而Lsi2 沒(méi)有參與此過(guò)程[28]。為了明確Lsi1對(duì)亞硒酸鹽的運(yùn)轉(zhuǎn)活性，Zhao 等[28]在酵母中表達(dá)lsi1 時(shí)發(fā)現(xiàn)，在偏酸性（pH 值為3.5，5.5）條件下，Lsi1 可促進(jìn)亞硒酸鹽的吸收；而在偏堿性（pH 值為7.5）條件下，Lsi1 對(duì)亞硒酸鹽的吸收能力沒(méi)有明顯變化。這可能是由于pH 值影響了亞硒酸鹽的解離[28]，在偏酸性條件下，主要是不帶電荷的H2SeO3/SeO2可通過(guò)水孔蛋白進(jìn)出細(xì)胞。

目前，尚沒(méi)有在植物中發(fā)現(xiàn)HSeO3-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。因?yàn)镠SeO3-與單羧酸結(jié)構(gòu)類似，McDermott 等[30]認(rèn)為，亞硒酸鹽可通過(guò)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Jen1p 進(jìn)行吸收，且溶液pH 值會(huì)影響其轉(zhuǎn)運(yùn)活性，在pH值為4.5～7.5 范圍內(nèi)，隨著pH 值降低，轉(zhuǎn)運(yùn)活性會(huì)提高；且質(zhì)子梯度解偶聯(lián)劑極大地抑制其轉(zhuǎn)運(yùn)活性[30]，說(shuō)明此轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程為質(zhì)子梯度推動(dòng)的或者是ATP 依賴的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。此結(jié)果與氰化物抑制單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，抑制細(xì)胞對(duì)乳酸、丙酮酸等的吸收[45-46]，以及解偶聯(lián)劑和低溫抑制水稻根細(xì)胞在pH 值為5.0 時(shí)對(duì)亞硒酸的吸收[26]是一致的。Lazard 等[29]發(fā)現(xiàn)，酵母磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在pH 值為6.0 時(shí)具有亞硒酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)活性。磷酸的Ka1，Ka2，Ka3分別為7.25×10-3，6.31×10-8和3.98×10-13，在pH 值為6.0 時(shí)磷酸鹽主要形態(tài)為H2PO4-，而亞硒酸鹽主要形態(tài)為HSeO3-。我們推測(cè)因HSeO3-與H2PO4-結(jié)構(gòu)類似，導(dǎo)致在此pH 值條件下，亞硒酸鹽可通過(guò)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。Li 等[23]也發(fā)現(xiàn)，植物磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了亞硒酸鹽的吸收。

在偏堿性條件下，亞硒酸鹽的主要形式為SeO32-[28]，水稻的亞硒酸鹽吸收量較酸性條件下吸收量少很多[26，28]，導(dǎo)致此現(xiàn)象的原因可能為植物對(duì)SeO32-吸收能力低或者在此條件下外排亞硒酸鹽能力提高。酵母亞硒酸鹽外排蛋白SSU1在酵母的耐硒過(guò)程中[47]具有重要的功能。植物體內(nèi)是否具有同樣功能的蛋白尚沒(méi)有報(bào)道。

亞硒酸鹽吸收途徑的多樣性導(dǎo)致植物對(duì)亞硒酸鹽的吸收量受到多種因素的影響，如呼吸抑制劑、代謝抑制劑、硝酸鹽、磷素營(yíng)養(yǎng)、pH 值及谷胱甘肽均可影響植物對(duì)亞硒酸鹽的吸收[22-27]。由圖1 可知，我們推測(cè)硒的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是由多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與的，除硒酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)主要通過(guò)硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行外，亞硒酸鹽基于其在不同酸堿度情況下的解離形式，推測(cè)分別利用水孔蛋白類通道轉(zhuǎn)運(yùn)H2SeO3/SeO2，酵母磷酸鹽和單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)HSeO3-，植物體內(nèi)是否存在SeO32-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及亞硒酸鹽外排蛋白尚不清楚。

目前，大部分硒的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)研究主要集中在植株水平上，為進(jìn)一步分析不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收硒能力的差異，建立硒酸鹽及亞硒酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)鑒定方法，進(jìn)而分析不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的硒通透能力、親和能力的差異，以及利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段分析其結(jié)構(gòu)差異，為深入探討不同植物耐硒能力差異的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

2 硒在植物體內(nèi)的同化代謝

植物從根部轉(zhuǎn)運(yùn)硒至地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)效率取決于根從土壤中吸收硒的類型，硒酸鹽被根系吸收后，可被運(yùn)輸?shù)降厣喜糠諿23，25]，在葉綠體內(nèi)進(jìn)行硒酸鹽同化（圖2）。而植物吸收的大部分亞硒酸鹽累積于根部[25]，木質(zhì)部的亞硒酸鹽含量很低[23，25]。這可能是由于亞硒酸鹽在根部很快被轉(zhuǎn)化為其他形式的硒化合物，如硒代甲硫氨酸（SeMet）和硒代甲硫氨酸水合物（selenomethionine Se-oxide hydrate，SeOMet）等，但大多數(shù)為非水溶性硒化合物[22-23]。

硒在植物體內(nèi)的同化代謝過(guò)程已經(jīng)被研究得較為清楚[21，48]（圖2），硒酸鹽進(jìn)入葉綠體后在ATP 硫酸化酶1（ATP sulfurylase 1，ATPS1）的催化下合成腺苷-5′-磷酰硒酸（Adenosine 5′-phosphoselenate，APSe）[49]，APSe 可被APS 還原酶2（APS Reductase 2，APR2）還原形成亞硒酸鹽[50-51]或者經(jīng)GSH 的還原生成亞硒酸鹽并進(jìn)一步還原成Se2-[48]，Se2-在半胱氨酸合成酶（Cys synthetase）的催化作用下合成SeCys。合成的SeCys 有多種代謝去路。SeCys 經(jīng)半胱氨酸裂解酶（selenocysteine lyase，SL）裂解成Se0和丙氨酸；或者在胱硫醚-γ-合成酶（Cystathionine-γ-synthase）的催化下形成硒代胱硫醚（Secystathionine，SeCysth），后被胱硫醚-β-裂解酶（Cystathionine-β-lyase）裂解為硒代高半胱氨酸（Sehomocysteine，SeHo-Cys）；也有部分SeCys 進(jìn)入胞液，在胞液中被SL裂解生成Se0，或者被硒代半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（SeCys methyltransferase，SMT）甲基化形成甲基硒代半胱氨酸（MSeCys），MSeCys 在相關(guān)酶的作用下進(jìn)一步甲基化形成具揮發(fā)性的二甲基二硒化物（DMDSe）[52-54]。另外一種形成揮發(fā)性硒化物的途徑為：葉綠體內(nèi)的SeHoCys 進(jìn)入胞液內(nèi)形成硒代甲硫氨酸，硒代甲硫氨酸被甲硫氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（MMT）甲基化形成甲基甲硫氨酸（MSeMet），MSeMet 進(jìn)一步甲基化形成揮發(fā)性二甲基硒化物（DMSe）。在葉綠體和胞液中的硒代半胱氨酸和硒代甲硫氨酸在一定條件下可取代半胱氨酸和甲硫氨酸參與蛋白質(zhì)的合成，使蛋白不能正確折疊[55-56]，甚至阻止mRNA 的翻譯[57]，從而導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受到抑制[58]。

3 展望

硒是一種重要的生命元素，它不僅是動(dòng)物、人類和微生物的必需元素[1-3]，也是植物生長(zhǎng)發(fā)育的有益元素[4-8]。自然環(huán)境中硒主要以硒酸鹽和亞硒酸鹽2 種氧化形態(tài)存在，植物和微生物可以吸收環(huán)境中的硒酸鹽和亞硒酸鹽，將其轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒被人類和動(dòng)物所利用。

硒酸鹽在植物體內(nèi)的同化代謝過(guò)程已較為清楚，普遍認(rèn)為，植物吸收硒酸鹽主要是通過(guò)硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行。利用突變體的研究結(jié)果表明，即使是同一類型的硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其轉(zhuǎn)運(yùn)硒酸鹽的能力也可能不同[36]?？山梃b離子通道的鑒定分析方法，建立硒酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)鑒定方法，為進(jìn)一步分析不同硒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)能力及特異性，比較同一物種不同的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及不同物種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)特異性及能力差異等奠定基礎(chǔ)。

某些植物水孔蛋白和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了亞硒酸鹽的吸收[23，26，59]，植物的單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是否也具有亞硒酸鹽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)活性尚不清楚。根據(jù)目前的結(jié)果，我們推測(cè)亞硒酸鹽的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)途徑為3 種對(duì)應(yīng)于H2SeO3/SeO2，HSeO3-和SeO32-的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和一種外運(yùn)途徑。這種亞硒酸鹽吸收途徑的多樣性，可能是影響細(xì)胞代謝、亞硒酸鹽形態(tài)等多種因素[22-27]以及亞硒酸鹽吸收量的原因。建立亞硒酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的標(biāo)準(zhǔn)鑒定方法，為進(jìn)一步分析鑒定不同形態(tài)亞硒酸鹽的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)載體及其特性、鑒定植物體內(nèi)的候選硒酸鹽外排蛋白等工作提供條件。

綜上所述，為深入研究分析植物硒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，亟待解決的問(wèn)題包括：（1）建立鑒定硒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白標(biāo)準(zhǔn)方法；（2）分析不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特性（Km，Vm，特異性等）；（3）克隆分析植物磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等的硒轉(zhuǎn)運(yùn)特性；（4）比較硒累積能力具有很大差異的植物同源硒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)能力差異；（5）明確植物是否外排硒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。這些問(wèn)題的闡明將有助于我們深入探討植物的富硒、耐硒原理，為進(jìn)一步通過(guò)培育富硒糧食作物滿足人類對(duì)硒的需求，培育耐硒植物進(jìn)行高硒環(huán)境的生物修復(fù)等奠定基礎(chǔ)。

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