生物醫(yī)用透明質(zhì)酸多糖的改性和功能化研究

吳莉嬌，欒 途，張 飛，張洪斌

上海交通大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院 高分子科學(xué)與工程系，上海200240

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)是一種天然聚陰離子粘多糖，由D-葡萄糖醛酸(glucuronic acid)和D-N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl glucosamine)以β-1，4 和β-1，3 糖苷鍵交替連接而成［1］，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1 所示。HA 幾乎存在于所有的哺乳動(dòng)物體中，通常以鹽的形式存在。在人體內(nèi)HA 分布廣泛，例如在眼玻璃體、關(guān)節(jié)液、臍帶和皮膚中均存在較高濃度的HA，肺、腎臟、大腦和肌肉組織里也發(fā)現(xiàn)有HA的存在。人體不斷地合成，也在不斷地代謝HA。HA 在生物體中具有多種生理和機(jī)械功能，如保持水分、調(diào)節(jié)滲透壓、維持組織形態(tài)、屏障擴(kuò)散、潤(rùn)滑關(guān)節(jié)、緩沖應(yīng)力等［2］。更為重要的是，HA 能夠被特定的細(xì)胞受體如CD44［3］識(shí)別，從而調(diào)控細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)和分化，調(diào)控免疫反應(yīng)、血管化和愈合等生理過(guò)程［4］。在具有上述重要生理功能的同時(shí)，由于HA在人體中是天然存在的，具有良好的生物相容性、生物降解性和非免疫原性，因此在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要和廣泛的應(yīng)用。

但是通過(guò)對(duì)HA 應(yīng)用效果的研究(如對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療和術(shù)后粘連的預(yù)防)發(fā)現(xiàn)，HA 無(wú)法提供持久的治療功效。這主要是由于HA 具有高水溶性，對(duì)自由基及透明質(zhì)酸酶敏感，容易發(fā)生降解［5］。HA體內(nèi)保留時(shí)間短，在水體系中缺乏力學(xué)強(qiáng)度［6］，限制了其應(yīng)用，因此對(duì)HA 進(jìn)行改性以提高其抗降解性和力學(xué)強(qiáng)度顯得尤為重要。許多學(xué)者對(duì)天然HA進(jìn)行了化學(xué)修飾或復(fù)合改性，以彌補(bǔ)上述不足，研發(fā)出了具有一定力學(xué)強(qiáng)度、高穩(wěn)定性的衍生物，其中部分衍生物已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和高級(jí)化妝品等領(lǐng)域。HA 可進(jìn)行改性的基團(tuán)包括羧基、羥基、乙酰氨基和還原末端。主要的化學(xué)改性方法有交聯(lián)、酯化、接枝等，而物理方法有復(fù)合改性。本文主要對(duì)近年的HA 改性研究及其醫(yī)學(xué)應(yīng)用進(jìn)行了詳細(xì)綜述。

圖1 透明質(zhì)酸的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 The molecular structure of hyaluronic acid

1 交聯(lián)改性

交聯(lián)是HA 形成凝膠的最普遍的改性方式，可以發(fā)生交聯(lián)的最重要的基團(tuán)是羧基和羥基。羥基通過(guò)醚鍵交聯(lián)，而羧基通過(guò)酯鍵交聯(lián)。交聯(lián)后，HA 分子量明顯增加，根據(jù)交聯(lián)程度的不同，交聯(lián)產(chǎn)物外觀上有明顯的差異。

1.1 羥基交聯(lián)

1.1.1 環(huán)氧化合物交聯(lián)

HA 可與多種環(huán)氧化合物在堿性條件下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，制備不同用途的凝膠。如Lebreton［7］采用1，4-丁二醇二縮水甘油醚、1，4-二(2，3-環(huán)丙氧基)丁烷及1，4-二縮水甘油丁烷等環(huán)氧化合物來(lái)交聯(lián)HA。Sakurai 等［8］采用多官能團(tuán)環(huán)氧化合物交聯(lián)HA，交聯(lián)密度可達(dá)每1000 個(gè)HA 雙糖重復(fù)單元至少有5 個(gè)交聯(lián)的重復(fù)單元。與未交聯(lián)HA 相比，這種交聯(lián)物更能抵抗透明質(zhì)酸酶的降解。

1.1.2 醛交聯(lián)

醛類(lèi)是常用的交聯(lián)劑之一。HA 和雙醛的交聯(lián)反應(yīng)被認(rèn)為是通過(guò)形成縮醛和半縮醛基團(tuán)而完成的［6］。HA 可以和戊二醛(GTA)發(fā)生化學(xué)交聯(lián)形成非水溶性膜［9］。然而，利用GTA 進(jìn)行交聯(lián)制得的生物材料易引起鈣化并且毒性高，這主要是由于無(wú)法完全除去產(chǎn)物中殘留的GTA 所致。Ramires 等采用GTA 蒸汽做交聯(lián)劑，制備了交聯(lián)聚乙烯醇-HA 膜。使用GTA 蒸汽對(duì)HA 進(jìn)行交聯(lián)被認(rèn)為是一種有效的避免交聯(lián)劑殘留的方法［10］。

1.1.3 砜交聯(lián)

HA 與二乙烯基砜(DVS)可在堿性水溶液中發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)制得凝膠。DVS 交聯(lián)的凝膠具有高度生物相容性、非抗原性以及非免疫原性，力學(xué)性能也得到大幅提高，可用作組織工程的支架材料［11］。Sannino 等［12］利用DVS 交聯(lián)HA 和纖維素衍生物制備了具有微孔結(jié)構(gòu)的水凝膠。該水凝膠對(duì)外部吸收媒介組分的變化很敏感，平衡吸收量比普通HA 凝膠高，有可能用于預(yù)防術(shù)后軟組織粘連。

1.2 羧基交聯(lián)

1.2.1 碳二亞胺(EDC)交聯(lián)

在酸性條件下，HA 與EDC 可發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)［13，14］。常用的EDC 交聯(lián)劑包括單碳二亞胺和雙碳二亞胺。EDC 交聯(lián)得到的HA 膜密度大、結(jié)構(gòu)剛性強(qiáng)，因而抗透明質(zhì)酸酶降解的能力得以增強(qiáng)［15］。Lu 等［16］對(duì)EDC 和GTA 交聯(lián)的HA 凝膠進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)EDC 交聯(lián)的HA 凝膠膜的抗拉伸能力更高，表面也更光滑、細(xì)胞毒性更小。Lai 等［17］研究了EDC 交聯(lián)的HA 凝膠在鼠眼前房中的生物相容性發(fā)現(xiàn)，與GTA 交聯(lián)的膜相比，這種凝膠膜具有更好的眼部生物相容性。EDC 催化HA 交聯(lián)可制備具有不同形態(tài)的衍生物，如薄膜、凝膠和纖維，可用于載體或者組織工程支架的材料等，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、力學(xué)強(qiáng)度高、透明、細(xì)胞相容性好的特點(diǎn)。EDC 交聯(lián)HA 還有其顯著的優(yōu)點(diǎn):EDC 本身并不進(jìn)入到最終產(chǎn)物中，僅作為交聯(lián)反應(yīng)的催化劑;EDC 作為交聯(lián)劑細(xì)胞毒性小，后處理比常用的戊二醛簡(jiǎn)單。

1.2.2 酰肼交聯(lián)

酰肼類(lèi)化合物也是比較常用的交聯(lián)劑，酰肼的氨基與HA 的羧基可發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)［18］。經(jīng)過(guò)酰肼交聯(lián)的HA 凝膠柔軟性、流動(dòng)性和溶解性降低，力學(xué)性能則有明顯的提高。常用的酰肼包括單酰肼、二酰肼和多酰肼。二酰肼和多酰肼連接到HA 分子上后，酰肼多余的氨基不僅可以與HA 分子的其它羧基反應(yīng)，發(fā)生分子內(nèi)或者分子間交聯(lián)，或者和其他小分子或聚合物發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，而且還可用于掛載藥物，從而可作為藥物載體［18］。此外，HA 與單酰肼和多酰肼反應(yīng)可制備生化傳感器以及具有生物相容性的組織工程支架，還可用作防術(shù)后粘連的原位交聯(lián)凝膠的前體［19］。Motokawa 等［20］制備了一種新型的可持續(xù)釋放紅細(xì)胞生成素(EPO)的HA 凝膠。Luo等［21］先將HA 轉(zhuǎn)化成己二酸二酰肼衍生物，再用帶雙官能團(tuán)的聚乙二醇-丙二醛作交聯(lián)劑制備出了可在幾秒內(nèi)迅速膨脹、水化后柔軟的凝膠干膜。Shiseido 公司［22］用二酰肼交聯(lián)濃縮的HA，制備出不溶于水的HA 凝膠。該HA 凝膠在一定交聯(lián)度內(nèi)是透明的，具有細(xì)胞毒性小、彈性適中、穩(wěn)定和生物降解性高的優(yōu)點(diǎn)，可注射進(jìn)人體，并支持藥物釋放體系。

1.2.3 二硫化物交聯(lián)

Shu 等［23］采用二硫基丙二酰肼(DTP)和二硫基丁二酰肼(DTB)作為交聯(lián)制備了硫醇改性的HA 凝膠。Liu 等［24］采用Shu 等［23］的方法制備了二硫化物交聯(lián)的HA 膜并發(fā)現(xiàn)這種膜具有良好的細(xì)胞相容性，體外降解也很慢。

1.3 氨基交聯(lián)

HA 在交聯(lián)前先進(jìn)行化學(xué)改性可形成其它化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)。比如，HA 用酸或堿處理可導(dǎo)致部分N-乙酰氨基中的乙?；撘阴；纬勺杂傻陌被?。這種自由的氨基可大大拓展HA 結(jié)構(gòu)修飾的途徑和方法。利用HA 脫乙?；蟮挠坞x氨基可進(jìn)行交聯(lián)改性制備交聯(lián)產(chǎn)物［25，26］。京尼平(Genipin)是一種新型的交聯(lián)劑，可由傳統(tǒng)中藥杜仲的活性成分京尼平甙中水解得到，也可人工合成［27］。Genipin 可自發(fā)地與氨基發(fā)生反應(yīng)，生成一個(gè)環(huán)烯醚萜氮化物，隨后經(jīng)過(guò)脫水作用，形成一個(gè)芳香族單體，該單體可經(jīng)由自由基反應(yīng)形成環(huán)狀的分子間和分子內(nèi)交聯(lián)結(jié)構(gòu)［28］，用其交聯(lián)脫乙?；疕A 可制備環(huán)狀交聯(lián)的HA。Genipin 廣泛應(yīng)用于生物制品中，但是也有其缺點(diǎn)，如其與氨基反應(yīng)過(guò)程中，會(huì)生成一種深藍(lán)色的色素，限制了其在制備淺色、透明等產(chǎn)品中的應(yīng)用，并且其價(jià)格也比較昂貴。

1.4 內(nèi)部酯化交聯(lián)

HA 內(nèi)部酯化衍生物是由HA 本身的羥基和羧基以分子內(nèi)和分子間交聯(lián)的方式得到的。由于是通過(guò)內(nèi)部反應(yīng)得到，因此未引入外來(lái)分子。這種自交聯(lián)透明質(zhì)酸(ACP)凝膠是完全生物相容的，體內(nèi)駐留時(shí)間長(zhǎng)，力學(xué)性能也得以改善［29］。Belluco 等［30］測(cè)試了ACP 凝膠的抗粘連作用，發(fā)現(xiàn)ACP 凝膠在1%濃度時(shí)就能防止腹部術(shù)后粘連。Pellicano 等［31］研究了ACP 凝膠在預(yù)防腹腔鏡子宮肌瘤剔除術(shù)后粘連的效用，發(fā)現(xiàn)ACP 確可作為潛在的防術(shù)后粘連劑。

2 非交聯(lián)改性

2.1 酯化改性

HA 的酯化改性在其羧基或羥基上進(jìn)行的，通過(guò)部分和全酯化反應(yīng)，可改善HA 的理化性質(zhì)和生物功能，提高穩(wěn)定性、溶解性。酯化HA 可通過(guò)擠出、冷凍干燥或者噴霧干燥而制成具有不同功能活性的材料，如薄膜、纖維、海綿、微球等。這類(lèi)新型材料有望用于臨床的各個(gè)領(lǐng)域。此外，酯化類(lèi)型和酯化程度也可影響這些材料的物理化學(xué)性質(zhì)及生物特性［32］。

2.1.1 羥基酯化

丁酸鹽［33-35］能夠抑制人體腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，但其半衰期短，易經(jīng)代謝排出體外。Speranza 等［36］通過(guò)丁酸和HA 的酯化反應(yīng)制備了新型組蛋白脫乙酰基酶阻聚劑(HA-But)。含HA 的靶向藥物能夠聚集于表達(dá)CP44 的細(xì)胞表面并通過(guò)內(nèi)容作用進(jìn)入細(xì)胞［37］。研究表明，HA-But 是一種潛在的細(xì)胞靶向抗腫瘤劑，可用于治療原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤。最近發(fā)展的“生物打印機(jī)(bio-printer)”為解決器官移植帶來(lái)了希望［38］。生物打印機(jī)的“墨水”是細(xì)胞聚集體或者多細(xì)胞的合成細(xì)胞外基質(zhì)，“紙”是可為“墨水”提供支架或者基質(zhì)的聚合物。Skardal 等利用甲基丙烯酸化的透明質(zhì)酸(HA-MA)和明膠的甲基丙烯酸乙醇酰胺衍生物(GE-MA)，采用兩步光交聯(lián)技術(shù)制備了HA-MA/GE-MA 凝膠。這種光交聯(lián)生物材料解決了組織工程中打印凝膠來(lái)源不足的問(wèn)題［39］。

2.1.2 羧基酯化

紫杉醇是一種重要的抗腫瘤藥物，但單獨(dú)應(yīng)用時(shí)具有很多缺點(diǎn)，如溶解性低、有一定毒性等［40］。為了克服這些缺陷，Lee［41］等制備了HA-紫杉醇化學(xué)軛合物，以獲得更好的藥物溶解性、穩(wěn)定性、靶向性和控釋性。商品化的紫杉醇通常用蓖麻油/乙醇作為溶媒以增加其溶解性，但是也因此產(chǎn)生了很多副作用［42］。Rosato 等［42］制備了一種新型的水溶性紫杉醇-HA 結(jié)合物，由HA 的羧基和紫杉醇通過(guò)酯化反應(yīng)合成。和傳統(tǒng)的紫杉醇相比，其水溶性大幅提高。

2.2 接枝改性

HA 的接枝反應(yīng)是將小分子物質(zhì)或聚合物接枝到HA 主鏈上。所形成的聚合物作為藥物載體，可充分利用HA 與細(xì)胞表面受體CD44 或其它HA 受體蛋白的結(jié)合能力，達(dá)到藥物靶向運(yùn)送的目的。Huang 等［43］將低分子量瓊脂糖用表氯醇激活后和HA 接枝合成了瓊脂糖接枝的透明質(zhì)酸(Ag-g-HA)，可作為胰島素釋放載體。Cho 等［44］利用EDC 和N-羥基琥珀酰亞胺做偶聯(lián)劑，將末端帶氨基的泊洛沙姆接枝到HA 上用于眼部藥物的載體。Pitarresi等［45］將HA 接枝到聚乳酸(PLA)和聚乙烯乙二醇(PEG)上，研制了自組裝兩性分子HA 接枝共聚物來(lái)包裹抗腫瘤藥物。Varghese 等［46］合成了一種新型胍基化試劑，并用其改性HA 制備非病毒性基因/siRNA 傳遞載體。Di Meo 等［47］通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)合成了兩種帶有碳硼烷的新型HA 衍生物，用于硼中子捕獲療法。Oldinski 等［48，49］將HA 與高密度聚乙烯(HDPE)接枝共聚，制備了有望用于組織修復(fù)的高分子共聚物材料。

2.3 疏水改性

Zhang 等［50］通過(guò)甲硅烷基化反應(yīng)合成了一種新型HA 衍生物，增加了HA 的疏水性，增強(qiáng)了其在普通有機(jī)溶劑中的溶解性。Lapcik 等［51］也對(duì)HA 進(jìn)行了疏水改性，結(jié)果顯示烷基化HA 大分子流變學(xué)性能有了明顯的改變。Charlot 等［52］合成了分別帶有β-環(huán)糊精和金剛烷的透明質(zhì)酸支化衍生物。此兩種物質(zhì)在水溶液中可以形成新型的“主-客”超分子自組裝復(fù)合物，并且表現(xiàn)出顯著的粘彈特性。

3 復(fù)合改性

3.1 與其它多糖復(fù)合

穩(wěn)定蛋白質(zhì)最常用的方法是凍干法，但是這種方法對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和再水化后的活性具有不良的影響。Zhang 等［53］發(fā)現(xiàn)HA-海藻糖復(fù)合物是穩(wěn)定胰激肽原酶(PKase)的有效輔料。Majima 等［54］制備了殼聚糖(CS)和HA 復(fù)合物，用做韌帶和肌腱組織工程支架材料。CS 和HA 還可通過(guò)離子作用自發(fā)形成納米粒子載體，包裹大分子藥物肝素，用于肺部釋藥［55］。臨床上，多佐胺(DH)和噻嗎洛爾(TM)可用于青光眼的治療，但其具有生物利用度低、藥物接觸時(shí)間短等缺點(diǎn)。Wadhwa 等［56］用HA/CS 納米粒子(CS-HA-NPs)裝載TM 和DH，與不含HA 的CSNPs 相比，CS-HA-NPs 造成的眼內(nèi)壓力顯著下降，粘著強(qiáng)度和效率有大幅提高，更能滿(mǎn)足眼部釋藥載體的要求。Tan 等［57］將HA 引入殼聚糖-明膠(CSGel)體系，制成CS-Gel-HA 復(fù)合材料。這種復(fù)合材料可有效地縮短細(xì)胞在支架材料表面的適應(yīng)期，抑制材料表面細(xì)胞的凋亡。

3.2 膠原蛋白復(fù)合

膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的一種主要結(jié)構(gòu)蛋白，支持多種不同組織的生長(zhǎng)，與HA 復(fù)合能賦予它良好的力學(xué)特性。Park 等［58］制備了經(jīng)EDC 修飾的HA-膠原蛋白復(fù)合薄膜，該膜與用戊二醛作交聯(lián)劑制得的膜相比，對(duì)酶解的抵抗力大幅提高，含水量高達(dá)98%，無(wú)明顯細(xì)胞毒性，可用于組織工程中三維細(xì)胞培養(yǎng)的支架。

3.3 與聚乳酸-羥基乙酸共聚物(Poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)復(fù)合

PLGA 是一種獲美國(guó)FDA 批準(zhǔn)可應(yīng)用于人體的高分子合成材料［59］，具有良好的生物力學(xué)強(qiáng)度，容易加工，而且藥物控釋可持續(xù)幾天到幾個(gè)月，已廣泛用于組織工程支架等領(lǐng)域［60］。將HA 固定到多孔、可降解的PLGA 支架的表面，制成HA 改性的PLGA支架，可增強(qiáng)軟骨組織中軟骨細(xì)胞的粘附、增殖和分化［61］。

3.4 與超高分子量聚乙烯(UHMWPE)復(fù)合

UHMWPE 由于具有優(yōu)良的機(jī)械性能、生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性，因此在臨床上被用作人工關(guān)節(jié)軟骨-關(guān)節(jié)臼材料。但是此材料的抗磨性并不理想，在應(yīng)用過(guò)程中會(huì)不斷產(chǎn)生微米尺寸磨屑，影響使用效果和壽命。Zhang 等［62，63］通過(guò)將UHMWPE 與硅烷化的HA 復(fù)合制備了一種微復(fù)合材料。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試，此種新型材料與不添加HA 的UHMWPE 聚乙烯材料相比最高可降低56%的磨損。

4 結(jié)論與展望

自從1934 年HA 被首次發(fā)現(xiàn)和制備以來(lái)，經(jīng)歷了近八十年的研究與開(kāi)發(fā)，人們對(duì)其結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、生物功能已有了相對(duì)較明確的認(rèn)識(shí)。隨HA 市場(chǎng)需求的與日俱增和臨床應(yīng)用的推廣，針對(duì)不同用途的HA 及其改性衍生物的需求正不斷增大。目前，HA 研究和開(kāi)發(fā)已成為材料學(xué)、生物學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)及生物組織工程學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。HA 由于其獨(dú)特的理化性質(zhì)和生理功能將得到更廣泛的應(yīng)用。

眾多學(xué)者對(duì)HA 進(jìn)行了物理改性和化學(xué)改性，在一定程度上克服了其易降解，在組織內(nèi)停留時(shí)間短的缺點(diǎn)。以HA 為基礎(chǔ)的凝膠具有高度生物相容性，而且加工制備容易，因此這種材料在醫(yī)學(xué)上會(huì)有很大的應(yīng)用潛力。在非高力學(xué)強(qiáng)度要求的應(yīng)用領(lǐng)域，HA 凝膠材料已顯示出獨(dú)特的綜合性能優(yōu)勢(shì)。但力學(xué)穩(wěn)定性對(duì)組織工程材料而言十分重要，迄今為止還不能獲得具有滿(mǎn)意力學(xué)強(qiáng)度的HA 凝膠以適應(yīng)各種應(yīng)用需求。多糖基水凝膠在要求材料具有高韌性和抗疲勞性能的動(dòng)態(tài)加載環(huán)境下仍處于劣勢(shì)。如何獲得完全無(wú)細(xì)胞毒性、高力學(xué)強(qiáng)度的HA 凝膠材料仍然是努力目標(biāo)。相信未來(lái)一些年，HA 交聯(lián)產(chǎn)物及其衍生物的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用將得到進(jìn)一步地重視，HA 研究特別是交聯(lián)改性還會(huì)有更快、更深入的發(fā)展。

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