藍(lán)莓提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用研究

沈 瀟，孫曉紅* ，趙 勇，謝慶超，吳啟華，潘迎捷

1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306;2 美國(guó)緬因大學(xué)食品科學(xué)與人類營(yíng)養(yǎng)系，緬因04469

藍(lán)莓又稱越橘、藍(lán)漿果，是一種極耐寒的野生植物。其果實(shí)不僅肉質(zhì)細(xì)膩、酸甜適中，而且營(yíng)養(yǎng)豐富，因此被譽(yù)為“漿果之王”。果實(shí)中最具吸引力的營(yíng)養(yǎng)成分當(dāng)數(shù)其中含量豐富的酚類物質(zhì)，研究表明，藍(lán)莓中的酚類物質(zhì)具有抑菌、抗炎［1］、抗癌［2］等活性，而且在相應(yīng)的抑制濃度下不影響動(dòng)物體細(xì)胞的正常生長(zhǎng)［3］。有報(bào)道指出，藍(lán)莓中的酚類物質(zhì)能顯著降低菌體細(xì)胞對(duì)腸道上皮組織的粘附性［4］。陳玉峰等研究表明藍(lán)莓能抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，且抑菌效果隨色素濃度的增加而增強(qiáng)［5］。

金黃色葡萄球菌是引起細(xì)菌性食物中毒的重要致病菌之一，主要通過(guò)食品傳播。據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防控制中心的統(tǒng)計(jì)，金黃色葡萄球菌在引起食物中毒的病原菌中占第2 位［6］。相關(guān)報(bào)道顯示［7］，2003～2007 年深圳市南山區(qū)274 起細(xì)菌性食物中毒事件中，由金黃色葡萄球菌所引起的食物中毒事件比率為14.2%?？股厥侵委熃瘘S色葡萄球菌感染的常見(jiàn)方法，但此方法使金黃色葡萄球菌的耐藥性增長(zhǎng)迅速，大部分抗生素已難以抑制其生長(zhǎng)［8］。

植物體內(nèi)富含生物活性化合物，其中大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)具有抑菌活性。而天然的抑菌劑相對(duì)于合成的化合物來(lái)說(shuō)更加安全和健康，所以現(xiàn)在很多天然產(chǎn)物被廣泛關(guān)注，并用來(lái)預(yù)防和治療由細(xì)菌引起的各種疾?。?］。本研究選取四種在我國(guó)栽培時(shí)間長(zhǎng)、遺傳性狀穩(wěn)定且產(chǎn)量高的藍(lán)莓代表種為原料，研究其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果，為今后藍(lán)莓抑菌活性物質(zhì)的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

藍(lán)莓:Elliott、Darrow、Bluecrop 和Duke 均由青島沃林農(nóng)業(yè)公司提供，四種藍(lán)莓屬北高叢藍(lán)莓(Highbush Blueberry)。金黃色葡萄球菌(AB91093)購(gòu)自上海疾病預(yù)防與控制中心。沒(méi)食子酸、無(wú)水乙醇，乙酸乙酯，鹽酸均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。ODS-A C18 填料購(gòu)于北京金歐亞科技有限公司。胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)，胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 藍(lán)莓提取物的制備

取四個(gè)品種的冷凍藍(lán)莓，進(jìn)行微波加熱并快速解凍，洗凈原料，使用均質(zhì)機(jī)充分?jǐn)囁椋Q取20.0 g藍(lán)莓漿置于200 mL 75%乙醇中，于室溫超聲粉碎30 min，過(guò)濾，濾液于4000 rpm 離心20 min，取上清液于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，待乙醇揮發(fā)完全后，將上清液濃縮至2 g/mL，總體積為10 mL，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 藍(lán)莓對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性測(cè)定

將四種藍(lán)莓提取物分別用滅菌胰蛋白胨肉湯(TSB)配制為以下濃度:900，450，225，112. 5 mg/mL，每支試管總體積為2 mL，取10 μL 5 logCFU/mL金黃色葡萄球菌菌液依次接入相應(yīng)濃度的藍(lán)莓提取物中。同時(shí)，根據(jù)FDA 的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［10］，將山梨酸鉀用無(wú)菌TSB 稀釋至2 mL，使其最終濃度為2 mg/mL。取10 μL 含有約5logCFU/mL 的金黃色葡萄球菌菌液接入試管中。用1 mL 的無(wú)菌水代替藍(lán)莓提取液作為對(duì)照組，操作同上，37 ℃培養(yǎng)24 h，用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定

將四種藍(lán)莓提取物與山梨酸鉀用滅菌TSB 分別配制2 mL 的濃度為:100，200，300，350，400，600，800 和1080 mg/mL 的溶液，分別接入10 μL 含有5logCFU/mL 的金黃色葡萄球菌。對(duì)照組取1 mL 無(wú)菌水代替藍(lán)莓提取物加入1 mL TSB 中，加入10 μL含有約5logCFU/mL 菌液并于37 ℃培養(yǎng)24 h，用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 藍(lán)莓中總酚含量的測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu 法測(cè)定藍(lán)莓中總酚酸含量［11］。準(zhǔn)確吸取0.1 mL 樣品液于100 mL 容量瓶中，加50 mL 蒸餾水，再加入4 mL Folin-Ciocalteu 試劑搖勻，靜置5 min，加入8 mL 10% Na2CO3，蒸餾水定容，置于25 ℃的恒溫水浴鍋中2 h，顯色后于最大波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得相對(duì)應(yīng)的濃度，并按下列公式計(jì)算多酚含量。

式中，ω 為多酚含量(mg /g);C 為沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度(μg/mL);V 為提取液體積(mL);N 為稀釋倍數(shù);M 為取樣量(g)。

1.2.5 藍(lán)莓中還原糖含量測(cè)定

藍(lán)莓中的還原糖含量采用國(guó)標(biāo)法［12］進(jìn)行測(cè)定。吸取5.0 mL 堿性酒石酸銅甲液與5.0 mL 酒石酸銅乙液于150 mL 錐形瓶中，加水10 mL，加入兩粒玻璃珠，從滴定管中加比預(yù)測(cè)體積少1mL 的試樣溶液至錐形瓶中，使其在2 min 內(nèi)加熱煮沸，保持沸騰繼續(xù)以1 滴/2s 的速度滴定，直至藍(lán)色剛好褪去為終點(diǎn)，記錄樣液消耗體積，平行測(cè)定3 次，得出平均消耗體積。

式中，χ 為試樣中還原糖含量(以葡萄糖計(jì))，單位為g/100g;m1為堿性酒石酸銅溶液(甲、乙液各半)相當(dāng)于某種還原糖的質(zhì)量，單位為mg;m 為試樣質(zhì)量，單位為g;V 為測(cè)定時(shí)，平均消耗的試樣溶液體積，單位為mL。

1.2.6 酚類物質(zhì)抑菌活性測(cè)定

參照吳啟華等［13］方法，對(duì)藍(lán)莓提取物進(jìn)行純化。各取1 mL 濃度為1 g/mL 的四種藍(lán)莓提取物加入C18反相柱中，以1% HCl 水溶液除去藍(lán)莓中的糖分和有機(jī)酸。再用乙酸乙酯對(duì)藍(lán)莓中的酚類物質(zhì)進(jìn)行洗脫，并收集洗脫液于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去乙酸乙酯，將濃縮后的酚酸溶于3 mL 無(wú)菌水中，置于-20℃保存?zhèn)溆?。參?.2.4 中總酚測(cè)定方法，對(duì)其中酚類物質(zhì)的含量進(jìn)行測(cè)定。

將四種藍(lán)莓用無(wú)菌TSB 分別配制成2 mL 的濃度為0.2 mg/g 的溶液，用無(wú)菌移液器吸取10 μL 5 log CFU/mL 金黃色葡萄球菌菌液，依次接入相應(yīng)的藍(lán)莓液中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果

四種藍(lán)莓提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果見(jiàn)表1。四種藍(lán)莓提取物對(duì)金黃色葡萄球菌均有抑制作用。其中，Elliott 和Darrow 對(duì)其抑制效果明顯強(qiáng)于Bluecrop 和Duke。當(dāng)藍(lán)莓濃度達(dá)到450 mg/mL 時(shí)，Elliott 和Darrow 能完全殺死金黃色葡萄球菌。而Duke 和Bluecrop 在450 mg/mL 時(shí)，對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)抑制效果不明顯。當(dāng)四種藍(lán)莓濃度達(dá)到900 mg/mL 時(shí)，均未檢測(cè)到金黃色葡萄球菌。山梨酸鉀溶液在2 mg/mL 時(shí)，不能抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。

表1 四種藍(lán)莓對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果(n=6，±s)Table 1 The antimicrobial effects of four blueberry extracts (n=6，±s)

表1 四種藍(lán)莓對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果(n=6，±s)Table 1 The antimicrobial effects of four blueberry extracts (n=6，±s)

注:a 表示經(jīng)24 h 培養(yǎng)后，處理組菌落總數(shù)和對(duì)照組菌落總數(shù)有顯著性差異(p ＜0.05)。Note:a Represents a significant (P ＜0.05)difference from control at 24 h(p ＜0.05).

藍(lán)莓品種Blueberries濃度Concentrations(mg/mL)菌落總數(shù)Colong-Forming Onits(log CFU/mL)0 h 24 h對(duì)照Control 0 5.27 ±0.66 7.79 ±0.38山梨酸鉀Potassium sorbate 2 5.27 ±0.66 9.13 ±0.15a杜克Duke 112.5 6.00 ±0.060 8.68 ±0.39 225 5.89 ±0.029 7.31 ±0.30 450 6.05 ±0.12 7.08 ±0.035 900 5.96 ±0.09 6.11 ±0.24a達(dá)柔Darrow 112.5 6.06 ±0.60 7.42 ±0.30 225 5.95 ±0.47 7.40 ±0.48 450 6.16 ±0.58 0.00a 900 5.57 ±0.43 0.00a埃利奧特Elliott 112.5 6.00 ±0.44 7.52 ±0.43 225 5.79 ±0.62 6.53 ±0.52a 450 5.41 ±0.33 0.00a 900 5.68 ±0.49 0.00a藍(lán)豐Bluecrop 112.5 5.95 ±0.40 8.38 ±0.37 225 5.98 ±0.46 8.20 ±0.37 450 5.91 ±0.88 7.56 ±0.45 900 5.81 ±0.49 0.00 a

2.2 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)

四種藍(lán)莓提取物和山梨酸鉀溶液對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度見(jiàn)表2。

表2 四種藍(lán)莓提取物及山梨酸鉀溶液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC 及MBC 測(cè)定結(jié)果Table 2 The MIC and MBC of different blueberry extracts and potassium sorbate

由表可見(jiàn)，四種藍(lán)莓提取物中，Elliott 提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最強(qiáng)。

2.3 藍(lán)莓中總酚酸和還原糖含量的測(cè)定

藍(lán)莓提取物中總酚酸和還原糖含量的含量見(jiàn)表3。其中，Darrow 中總酚酸含量最高，達(dá)到1.99 mg/g。Duke 中總酚酸含量最低，僅為1.32 mg/mL。四種藍(lán)莓中，Elliott 中還原糖的含量最低，而Duke 中還原糖含量最高，達(dá)191.90 mg/mL。

表3 四種藍(lán)莓中總酚酸與還原糖含量Table 3 The content of total phenolic and reducing sugar of different blueberry extracts

2.4 酚類物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用

表4 顯示四種藍(lán)莓經(jīng)分離純化之后獲得的酚類物質(zhì)中總酚含量。其中，Darrow 中總酚酸含量最高，達(dá)到0.46 mg/g，Elliott 中總酚含量次之，Duke中總酚含量最低。圖1 顯示，藍(lán)莓中酚類物質(zhì)具有明顯的抑菌活性。在0.2 mg/g 的濃度下，酚類物質(zhì)均能有效殺死金黃色葡萄球菌。

3 討論

藍(lán)莓味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，更因其突出的生理活性而備受關(guān)注。本研究中四種藍(lán)莓提取物均能顯著抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。其中，Elliott(300 mg/mL)和Darrow(350 mg/mL)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果尤為顯著，均能在低濃度時(shí)抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。Bluecrop 和Duke 對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑制作用明顯弱于Elliott 和Darrow。同時(shí)，經(jīng)純化所得的藍(lán)莓酚類物質(zhì)在0.2 mg/mL 時(shí)，均對(duì)金黃色葡萄球菌顯示出顯著的抑菌效果。和粗提物的抑菌效果相比較，發(fā)現(xiàn)，酚類物質(zhì)的抑菌活性更強(qiáng)，在0.2 mg/mL 的濃度下就可完全殺滅金黃色葡萄球菌。藍(lán)莓粗提物和酚類物質(zhì)間抑菌效果的差別可能與其所含成分的復(fù)雜程度有關(guān)。藍(lán)莓粗提物中所含成分較多，物質(zhì)間較易發(fā)生協(xié)同或拮抗作用，從而影響藍(lán)莓的抑菌效果，使其抑菌活力增強(qiáng)或減弱。而藍(lán)莓酚類物質(zhì)中成分相對(duì)簡(jiǎn)單，物質(zhì)間的相互作用較少，酚類物質(zhì)更能顯示其抑菌活性。研究結(jié)果所示，藍(lán)莓中的酚類物質(zhì)能為藍(lán)莓的抑菌活性提供了幫助。

表4 四種酚類物質(zhì)中總酚酸含量Table 4 The content of total phenolic acid of different phenolic compounds

圖1 四種酚類物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制活性測(cè)定Fig.1 The antimicrobial effect of phenolic compounds against S.aureus

藍(lán)莓是酚類物質(zhì)的良好來(lái)源，具有提高機(jī)體免疫力，延緩衰老抗癌等多種生理活性功能［12，13］。本研究不僅研究了藍(lán)莓的抑菌效果，還測(cè)定了四種藍(lán)莓中總酚酸和還原糖的含量，發(fā)現(xiàn)Darrow 和Elliott粗提物中酚酸的含量明顯高于另外兩種藍(lán)莓，分別達(dá)到1.99 mg/mL(Darrow)和1.75 mg/mL(Elliott)。同時(shí)，通過(guò)測(cè)定純化后的藍(lán)莓提取物中總酚含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Darrow 中總酚含量最高，Elliott 中總酚含量次之，而Bluecrop 和Duke 中總酚含量相近。而Darrow 和Elliott 中還原糖含量卻明顯低于Bluecrop和Duke。研究結(jié)果表明，藍(lán)莓中所含的酚酸和還原糖含量因品種不同而具有顯著差異，且其抑菌活性和酚酸、還原糖的含量有緊密聯(lián)系。酚酸是一類苯環(huán)上有若干個(gè)酚羥基的化合物，其所帶有的酚羥基能破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，使細(xì)菌內(nèi)的蛋白質(zhì)變性，并可抑制微生物細(xì)胞的呼吸酶系與電子傳遞酶系的活性，從而殺死細(xì)菌。故酚酸含量越高，酚羥基的數(shù)目也越多，對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞作用就越強(qiáng)，抑菌效果越明顯。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)Elliott 的抑菌效果明顯強(qiáng)于Darrow 的抑菌效果，但Elliott 中總酚酸的含量卻低于Duarrow 中總酚酸的含量。在植物體內(nèi)酚往往不單是以游離形式存在的，而通過(guò)縮醛鍵與還原糖結(jié)合存在，形成糖苷。糖苷在堿性條件下穩(wěn)定，遇酸易水解。酚酸類物質(zhì)以糖苷形式存在于藍(lán)莓中，更容易維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而保護(hù)其抑菌活性不受外界環(huán)境干擾。在四種藍(lán)莓中，雖然Elliott 中總酚酸的含量低于Darrow 中總酚的含量，但是其所含還原糖含量比Darrow 低，這說(shuō)明在Elliott 中更多的酚酸類物質(zhì)能和游離狀態(tài)的還原糖生成糖苷類，從而有效保證藍(lán)莓的抑菌活性不受外界環(huán)境干擾。通過(guò)本研究可得出結(jié)論，藍(lán)莓抑菌能力和酚含量呈正相關(guān)，而與還原糖含量呈負(fù)相關(guān)。

山梨酸鉀抑菌活性實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果顯示，山梨酸鉀在低濃度時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌無(wú)抑菌作用，只有在濃度達(dá)到100 mg/mL 時(shí)方可抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。雖然，山梨酸鉀溶液可被人體代謝系統(tǒng)吸收，迅速分解成二氧化碳和水，對(duì)人體無(wú)毒害，是目前使用最為廣泛的抑菌劑，但FDA/WHO 嚴(yán)格規(guī)定其在食品中所能使用的最大劑量不能超過(guò)2 g/kg。本實(shí)驗(yàn)中，山梨酸鉀溶液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC 已達(dá)100 mg/mL，遠(yuǎn)超過(guò)FDA/WHO 所規(guī)定山梨酸鉀的最大使用劑量。由此可見(jiàn)，山梨酸鉀溶液對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑制效果不如藍(lán)莓提取物。

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