羊耳菊抗菌物質(zhì)及其抑菌特性分析

謝慧婷，王 靜，陳振東，2，袁高慶* ，黎起秦，林 緯

1 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧530004;2廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，南寧530007

羊耳菊Inula cappa (Buch.-Ham.)DC.為菊科旋覆花屬植物，主要分布于熱帶和亞熱帶的亞洲國(guó)家，位于亞高山、低山、干燥或濕潤(rùn)丘陵地、荒地、草地等。羊耳菊是傳統(tǒng)的藥用植物，含有多種有效活性成分，在醫(yī)藥藥理作用和臨床醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用研究得比較廣泛，已報(bào)道該植物所含化學(xué)成分有揮發(fā)油類、萜類、甾體類、有機(jī)酸類、芳香化合物、酰胺類、黃酮類、醇類、蒽醌類、香豆素類等［1］。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面，平新亮等［2］曾報(bào)道羊耳菊甲醇提取物對(duì)菜青蟲3 齡幼蟲具有殺蟲活性，藥后72 h 的校正死亡率為50%，而在農(nóng)用殺菌活性方面的應(yīng)用迄今未見(jiàn)報(bào)道。

在前期篩選抑菌植物時(shí)，本文作者發(fā)現(xiàn)羊耳菊莖部甲醇提取物對(duì)水稻紋枯病菌具有較強(qiáng)的抑制作用。水稻紋枯病由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)引起，是遍及全球的水稻重要病害，目前多采用抗生素和化學(xué)藥劑防治。在過(guò)去的30 年里，大量持續(xù)的使用井岡霉素已導(dǎo)致我國(guó)水稻紋枯病菌產(chǎn)生一定的抗藥性［3］，研究和開發(fā)新型生物藥劑是一項(xiàng)水稻生產(chǎn)中亟待解決的問(wèn)題。植物源農(nóng)藥因其生物活性高、安全性高、易降解、與環(huán)境相容性好、不易引起抗性等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)今國(guó)內(nèi)外植保工作者的研究熱點(diǎn)之一。植物源農(nóng)藥的種類包括植物源殺蟲劑、植物源殺菌劑和植物源除草劑。我國(guó)地大物博，植物種類繁多，豐富的植物資源為植物源殺菌劑的研究提供了充足的資源保障。

本試驗(yàn)以水稻紋枯病菌為對(duì)象，對(duì)羊耳菊中的活性物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定并測(cè)定分析其抑菌特性，以期為利用該抗菌物質(zhì)開發(fā)防治水稻紋枯病的植物源殺菌劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

羊耳菊采自廣西金秀瑤族自治縣。羊耳菊莖部陰干粉碎后備用。

1.2 供試植物病原菌

供試植物病原真菌有:水稻紋枯病菌(R. solani)、杧果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. niverum)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、玉米小斑病菌(Bipolaria maydis)、茉莉枝枯病菌(Phoma putaminum)、番茄白絹病菌(Sclerotium rolfsi)、香蕉炭疽病菌(C.musae)、香蕉假尾孢葉斑病菌(Pseudocercospora musae)、香蕉彎孢霉葉斑病菌(Curvularia lunata)、柑桔褐色蒂腐病菌(Phompsis cytosporella)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、煙草黑脛病菌(Phytophthora nicotianae)、黃曲霉(Aspergillus flavus)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、甘藍(lán)黑斑病菌(Alternaria brassicae)。

植物病原細(xì)菌有:白菜軟腐病菌(Pectobacterium carotovora pv. carotovora)、辣椒青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、番茄瘡痂病菌(Xanthomonas vesicatoria)和木薯細(xì)菌性枯萎病菌(Xanthomonas axonopodis pv.manihotis)。

以上植物病原菌菌株均由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理學(xué)研究室提供。病原真菌的培養(yǎng)除煙草黑脛病菌用燕麥瓊脂(Oat Meal Agar，OMA)培養(yǎng)基培養(yǎng)外，其他用馬鈴薯蔗糖瓊脂(Potato Sucrose Agar，PSA)培養(yǎng)基培養(yǎng);細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨瓊脂(Nutrient Agar，NA)培養(yǎng)基和NA 培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.3 抑菌物質(zhì)的提取分離和鑒定

參照溶劑浸漬法［4］，用甲醇溶劑浸泡羊耳菊莖部干粉(6000 g)，真空抽濾，減壓濃縮，獲得抑菌物質(zhì)的粗提物(189.6 g)。取100 g 粗提物，采用液-液萃取法［4］，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇4 種有機(jī)溶劑對(duì)羊耳菊甲醇提取物的水溶液進(jìn)行萃取，獲得各萃取物，測(cè)定其對(duì)水稻紋枯病菌的抑菌活性。

對(duì)具有較強(qiáng)抑菌活性的石油醚層萃取物(12.5 g)進(jìn)行硅膠柱層析，石油醚-丙酮洗脫(100∶0、80∶1、40∶1、10∶1、1∶1)，最后甲醇沖柱，得到Fr.1～14，對(duì)水稻紋枯病菌具有抑菌活性的組分集中在Fr.4～9，將其合并，以石油醚-乙酸乙酯洗脫(100∶0、99∶1、98∶2、98∶3、98∶4、98∶6、1∶1)，最后甲醇沖柱，得到Fr.1～10，F(xiàn)r.3 為橙紅色精油，具有較強(qiáng)抑菌活性。以低溫冷凍結(jié)晶法［5］對(duì)其固體結(jié)晶物進(jìn)行多次純化，最終獲得單體化合物(0.7 g)。采用波譜法對(duì)分離到的活性化合物進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定。

1.4 抑菌特性測(cè)定

1.4.1 抑菌活性測(cè)定

對(duì)植物病原真菌的活性測(cè)定采用菌絲生長(zhǎng)速率法［6］，具體操作步驟是:將供試菌物在PSA 或OMA平板上活化培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)滿大半培養(yǎng)皿時(shí)備用。用溶劑溶解供試樣品，與PSA 或OMA 培養(yǎng)基混勻，倒入直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿，制成厚薄均勻的含藥帶毒平板培養(yǎng)基，以含相同濃度溶劑的培養(yǎng)基作為對(duì)照。用直徑為5 mm 的打孔器切取供試菌菌落邊緣菌餅，反向接入含藥帶毒平板中央，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)對(duì)照菌落剛好長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑(mm)，以下列公式計(jì)算供試樣品對(duì)植物病原真菌的抑菌率。每處理均3 次重復(fù)。

抑菌率(%)= 100 ×(對(duì)照菌落直徑–處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-5)

采取抑菌圈法［6］測(cè)定供試樣品對(duì)植物病原細(xì)菌的抑菌活性。將25 mL 含有107CFU/mL 供試細(xì)菌的NA 培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，用滅菌的5 mm 打孔器打孔，每孔加入供試樣品藥液50 μL，同時(shí)以相同濃度的溶劑作為對(duì)照，置于28 ℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)48 h。每個(gè)處理3 次重復(fù)，十字交叉法測(cè)量抑菌圈的直徑，取平均值。

1.4.2 毒力測(cè)定

將供試樣品稀釋成一系列濃度梯度，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定其對(duì)水稻紋枯病菌的抑菌率。將藥劑濃度取對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)(x)，抑菌率換算成生物統(tǒng)計(jì)概率值作為縱坐標(biāo)(y)，采用DPS v8.01 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，以回歸分析法計(jì)算抑菌中濃度(EC50)。

1.4.3 抑菌化合物的穩(wěn)定性測(cè)定

將抑菌化合物置于不同的酸堿度(pH)、溫度、紫外光和熒光等條件下處理?；衔镌趐H 值分別為1、3、5、7、9、11、13 的溶液中靜置24 h;化合物藥液分別置于0、20、40、60、80、100 ℃環(huán)境里恒溫處理1 h;置于600 Lx 紫外燈下分別照射2、4、6、8、10 h;置于6000 Lx 日光燈下分別照射12、24、48、72、96 h。各條件處理的化合物均配制成50 mg/L 的藥液，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定其對(duì)水稻紋枯病菌的抑菌活性。以相同濃度的未經(jīng)處理的化合物作為對(duì)照。

1.4.4 抑菌化合物的抑菌譜測(cè)定

抑菌化合物的質(zhì)量濃度均為100 mg/L，以菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定其對(duì)16 種植物病原真菌的抑菌活性;以抑菌圈法測(cè)定其對(duì)4 種植物病原細(xì)菌的抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同萃取物對(duì)水稻紋枯病菌的抑菌活性分析

石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取物對(duì)水稻紋枯病菌的抑菌中濃度分別為135.20、1123.60 和3886.45 mg/L，正丁醇和水萃取物沒(méi)有抑菌活性。結(jié)果表明，羊耳菊對(duì)水稻紋枯病菌的抑菌活性物質(zhì)主要存在于石油醚萃取物中。

2.2 抑菌化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

將石油醚萃取物進(jìn)行硅膠柱層析分離和低溫冷凍純化，得到白色顆粒狀化合物，對(duì)水稻紋枯病菌的菌絲生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈抑制作用，抑菌中濃度為47 mg/L。該化合物的波譜數(shù)據(jù):1H NMR (600MHz，CDCl3)δ:7. 098～7. 085 (d，1H，-CH-)，6. 750～6.737 (d，1H，-CH-)，6.589～6.587 (s，1H，-CH-)，4.595 (s，1H，OH)，3.205～3.136 (m，1H，-CH-)，2.2849 (s，3H，-CH3)，1.260～1.248 (s，6H，-CH3);13C NMR (300 MHz，CDCl3)δ:152.516，136.612，131.293，126.238，121.681，116.022，26.737，22.671，20.857。與相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)照［7，8］，確定其為5-甲基-2-異丙基酚，即百里香酚(Thymol)，分子式為C10H14O。

2.3 百里香酚的抑菌活性穩(wěn)定性

不同pH 值溶液和不同溫度處理的百里香酚對(duì)水稻紋枯病菌的抑菌活性與對(duì)照一致;經(jīng)紫外光和熒光照射不同時(shí)間后，百里香酚對(duì)水稻紋枯病菌的抑菌活性沒(méi)有發(fā)生變化，說(shuō)明百里香酚的穩(wěn)定性較好。

2.4 百里香酚的抑菌譜

在16 種供試植物病原真菌中，除了對(duì)甘藍(lán)黑斑病菌的菌絲生長(zhǎng)具有微弱的促進(jìn)作用外，100 mg/L的百里香酚對(duì)其他15 種真菌均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用(見(jiàn)表1)，其中對(duì)水稻紋枯病菌、茉莉枝枯病菌、煙草黑脛病菌和香蕉彎孢霉葉斑病菌均表現(xiàn)出強(qiáng)烈抑制活性，它們的抑菌率沒(méi)有顯著差異;對(duì)瓜果腐霉、玉米大斑病菌、玉米小斑病菌和番茄白絹病菌也具有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌率大于70%;對(duì)西瓜枯萎病菌、杧果炭疽病菌和香蕉假尾孢葉斑病菌的抑菌活性相對(duì)較弱，抑菌率小于50%。

4 種供試植物病原細(xì)菌中，百里香酚對(duì)白菜軟腐病菌和木薯細(xì)菌性枯萎病菌的抑菌活性較強(qiáng)，抑菌圈直徑分別為16.62 和15.52 mm，對(duì)辣椒青枯病菌和番茄瘡痂病菌表現(xiàn)出微弱的抑菌活性(見(jiàn)表2)。

表1 百里香酚對(duì)植物病原真菌的抑菌活性Table 1 Antifungal activity of Thymol against plant pathogenic fungi

表2 百里香酚對(duì)植物病原細(xì)菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of Thymol against plant pathogenic bacteria

3 討論

本研究采用生物活性追蹤法，發(fā)現(xiàn)羊耳菊抑制水稻紋枯病菌的活性物質(zhì)主要存在于其甲醇提取物的石油醚萃取層，通過(guò)反復(fù)硅膠柱層析，從中分離純化出對(duì)水稻紋枯病菌具有較強(qiáng)抑菌活性的化合物，抑菌中濃度是47 mg/L，經(jīng)鑒定為百里香酚。

百里香酚(5-甲基-2-異丙基酚)，又名麝香草酚，具特殊香氣，存在于多種植物的精油中，有殺菌、抗氧化、消炎、祛痰、去蛔和除螨等活性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、香料業(yè)、食品業(yè)、化妝品業(yè)等行業(yè)［9］。雖然該化合物的理化性質(zhì)和功能都已比較明確，但對(duì)植物病原菌的活性研究甚少。張靜等［10］曾報(bào)道從地椒(Mongollian Thyme)中分離得到的百里香酚對(duì)番茄灰霉病菌、棉花立枯病菌、水稻紋枯病菌、辣椒疫霉病菌、小麥紋枯病菌、稻瘟病菌和煙草赤星病菌均具有很強(qiáng)的抑制作用。Ji 等［11］發(fā)現(xiàn)，將百里香酚作為熏蒸劑處理土壤后，對(duì)番茄青枯病取得明顯的防治效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，從羊耳菊中分離得的百里香酚經(jīng)過(guò)不同的酸堿度、溫度、紫外光和熒光等條件處理后，其抑菌活性仍較穩(wěn)定。該化合物除了對(duì)供試的甘藍(lán)黑斑病菌沒(méi)有抑菌活性外，對(duì)其他15 種植物病原真菌和4 種植物病原細(xì)菌均具有抑菌活性。綜合本文及別人的研究結(jié)果表明，百里香酚抑菌譜廣，活性穩(wěn)定，具有防治多種植物病害的潛力和開發(fā)成植物源殺菌劑的應(yīng)用前景。

致謝:本文采集的羊耳菊由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院黎樺副教授鑒定，在此表示衷心的感謝!

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