電針耳穴對(duì)D－半乳糖致年齡相關(guān)性聽力損失豚鼠聽覺中樞丙二醛表達(dá)的影響△

謝仕津 殷澤登 李君梅 賴丹 歐小毅 黎萬榮

隨著老齡化社會(huì)的到來，年齡相關(guān)性疾病受到越來越廣泛的關(guān)注。在老年人中，年齡相關(guān)性聽力損失（age－related hearing loss，AHL）是僅次于關(guān)節(jié)炎和高血壓的常見慢性疾病［1］。AHL 嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量，探索AHL 發(fā)病機(jī)制和防治措施尤為重要。研究顯示，針刺耳穴可有效治療突發(fā)性聾等感音神經(jīng)性聾［2，3］，但利用針刺耳穴來防治老年性聾及其機(jī)制方面的研究較少。因此，本研究通過建立D－半乳糖致年齡相關(guān)性聽力損失豚鼠模型，觀察電針對(duì)其聽功能以及聽皮層、下丘和耳蝸核組織中丙二醛表達(dá)的影響，以探討丙二醛在AHL發(fā)病中的作用、電針對(duì)AHL的防治作用及機(jī)制，為電針防治AHL提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取耳廓反射靈敏、無噪聲暴露及耳毒性藥物使用史的4月齡豚鼠30只（體重300～550g），飼養(yǎng)適應(yīng)一周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、D－半乳糖模型組、D－半乳糖＋電針組，每組10只。2年齡豚鼠10只（體重600～900g）為老年組，由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

D－半乳糖模型組于豚鼠頸背部皮下注射D－半乳糖［4～6］（C6H1206，AID SCIENCE，中國(guó)）300 mg·kg－1·d－1（40mg／ml），每日1次，連續(xù)6周。D－半乳糖＋電針組D－半乳糖的用法及用量同模型組，同時(shí)予以電針刺聽宮、翳風(fēng)兩個(gè)穴位。對(duì)照組給予等量生理鹽水頸背部皮下注射，每天1次，連續(xù)6周。2年齡組不做任何處理，常規(guī)飼養(yǎng)。在飼養(yǎng)過程中，仔細(xì)觀察各組動(dòng)物的外觀及表現(xiàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 電針 動(dòng)物清醒狀態(tài)下，用自制裝置固定，取雙側(cè)聽宮、翳風(fēng)穴［7］，用HM6805－I型經(jīng)穴治療儀（HM6805－I型，1100801072，四川恒明科技開發(fā)有限公司）刺激，疏密波，頻率14Hz，強(qiáng)度0.4～0.6 mA，連續(xù)輸出，9 次／秒，持續(xù)刺激15 min，每天一次，連續(xù)針刺6周。

1.2.2 ABR 波Ⅲ潛伏期檢測(cè) 于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)各組豚鼠行ABR 檢測(cè)，采用華中科技大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院耳鼻咽喉聽力室建立的方法進(jìn)行［8］。動(dòng)物用10%水合氯醛350mg／kg行腹腔注射麻醉，用腦干誘發(fā)電位儀（Intelligent Hearing Systems，美國(guó)智聽公司）測(cè)試，刺激聲為短聲（click），觀察110dB SPL刺激強(qiáng)度下各組豚鼠波Ⅲ潛伏期的變化。

1.2.3 丙二醛含量的檢測(cè) 測(cè)試ABR 后，動(dòng)物麻醉未醒前，斷頭、取雙側(cè)聽皮層、下丘、耳蝸核，立即用4 ℃生理鹽水洗凈血跡，放入－80 ℃冰箱中保存。硫代巴比妥酸法（TBA）法檢測(cè)丙二醛含量，操作步驟按丙二醛測(cè)試盒（20110110，南京建成生物工程研究所）說明進(jìn)行。按下列公式計(jì)算樣品中丙二醛的含量：組織中丙二醛含量（nmol／mgprot）＝［（測(cè)定管OD 值一測(cè)定空白管OD 值）／（標(biāo)準(zhǔn)管OD值－標(biāo)準(zhǔn)空白管OD 值）］×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10nmol／ml）／蛋白含量（mgprot／ml）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件，應(yīng)用單因素方差分析對(duì)各組間結(jié)果差異進(jìn)行比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 豚鼠外觀觀察 D－半乳糖模型組和老年組豚鼠毛色枯槁，無光澤，且頭頂部、背部、腹部掉毛嚴(yán)重；D－半乳糖模型組自造模4 周起，出現(xiàn)精神萎靡，倦怠嗜睡，進(jìn)食減少，皮膚松弛，行動(dòng)遲緩，自主活動(dòng)減少。對(duì)照組外觀及表現(xiàn)如實(shí)驗(yàn)前，D－半乳糖＋電針組外觀及表現(xiàn)介于D－半乳糖模型組和對(duì)照組之間。

2.2 各組豚鼠ABRⅢ波潛伏期的變化 刺激聲強(qiáng)度為110dB SPL 時(shí)，對(duì)照組、D－半乳糖模型組、D－半乳糖＋電針組和老年組ABR 波Ⅲ的潛伏期分別為0.89±0.88、1.06±0.14、0.90±0.10和1.00±0.10ms。與對(duì)照組比較，D－半乳糖模型組和老年組波Ⅲ潛伏期延長(zhǎng)（P＜0.05）；與D－半乳糖模型組比較，D－半乳糖＋電針組波Ⅲ潛伏期縮短（P＜0.05）；D－半乳糖模型組與老年組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 各組豚鼠聽皮層、下丘、耳蝸核中丙二醛的表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，D－半乳糖模型組和老年組豚鼠聽皮層、下丘、耳蝸核中丙二醛含量升高（P＜0.05）；與D－半乳糖模型組相比，D－半乳糖＋電針組三個(gè)部位丙二醛含量降低（P＜0.05）；D－半乳糖模型組與老年組相比，兩組之間丙二醛含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

3 討論

表1 各組豚鼠聽皮層丙二醛表達(dá)情況的比較（nmol／mgprot，±s）

表1 各組豚鼠聽皮層丙二醛表達(dá)情況的比較（nmol／mgprot，±s）

注：＊與對(duì)照組比較，P＜0.05；△與D－半乳糖模型組比較，P＜0.05

組別聽皮層下丘耳蝸核對(duì)照組1.17±0.34 0.81±0.22 2.27±0.56 D－半乳糖模型組 2.41±0.87＊1.61±0.70＊ 3.13±0.91＊D－半乳糖模型＋電針組1.45±0.88△0.98±0.20△ 2.16±0.73△老年組2.64±0.86＊1.74±0.62＊ 3.26±0.70＊

3.1 丙二醛在D－半乳糖致豚鼠年齡相關(guān)性聽力損失發(fā)病中的作用 近年來，自由基學(xué)說在AHL發(fā)生機(jī)制中的作用日益受到關(guān)注。隨著年齡的增加，機(jī)體抗氧化功能下降，氧自由基增多。氧自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，可形成過氧化脂質(zhì)，后者分解產(chǎn)生丙二醛。丙二醛能交聯(lián)蛋白質(zhì)與核酸，影響細(xì)胞的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成，還可導(dǎo)致線粒體膜損傷影響氧化磷酸化過程［9］，其含量的高低反映了細(xì)胞受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度。氧自由基可引起耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)鈣超載而死亡，從而導(dǎo)致AHL的發(fā)生［10］。本研究中，老年組豚鼠聽皮層、下丘和耳蝸核中丙二醛的含量均明顯增加，說明丙二醛參與了老年性聾的發(fā)生，而本研究中D－半乳糖模型組各級(jí)聽覺中樞中丙二醛的表達(dá)也顯著增加，說明氧自由基增加所致的氧化損傷機(jī)制可能參與了D－半乳糖所致的豚鼠AHL，這與周媛等［11］的研究結(jié)果類似。丙二醛導(dǎo)致聽覺中樞老化的機(jī)制可能與耳蝸的自由基氧化損傷機(jī)制相似［12］，當(dāng)然，這還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.2 電針刺耳穴對(duì)D－半乳糖致豚鼠年齡相關(guān)性聾的干預(yù)作用及機(jī)制 衰老機(jī)制的自由基學(xué)說［13］認(rèn)為：隨著年齡增長(zhǎng)，抗氧化酶活性下降，自由基對(duì)機(jī)體損傷累積進(jìn)而引起了衰老現(xiàn)象，在聽覺系統(tǒng)表現(xiàn)為聽力下降。因此，從抗氧化角度尋找能夠延緩、阻止疾病進(jìn)程的治療方法是目前AHL 臨床研究的主要方向之一。研究表明，針刺可明顯降低D－半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老小鼠和老年癡呆模型大鼠腦組織中丙二醛的含量，減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和丙二醛生成，減少神經(jīng)元的損傷，從而起到保護(hù)腦細(xì)胞、延緩衰老的作用［14，15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與D－半乳糖模型組相比，D－半乳糖模型＋電針組豚鼠ABR 波Ⅲ潛伏期縮短，聽皮層、下丘和耳蝸核中丙二醛含量顯著降低，說明電針治療可以降低聽覺中樞中丙二醛的產(chǎn)生，減少聽覺中樞神經(jīng)元的氧化損傷，從而延緩AHL的發(fā)生，但具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

研究表明，經(jīng)絡(luò)的循行與神經(jīng)、血管、淋巴管的循行分布基本一致，與人體應(yīng)激系統(tǒng)也有密切關(guān)系［16］。針刺穴位作用于人體經(jīng)絡(luò)，能夠促進(jìn)血液運(yùn)行，改善人體的新陳代謝，研究還發(fā)現(xiàn)，電針可加快耳部的血液循環(huán)、改善血液流變學(xué)的指標(biāo)，為耳神經(jīng)功能的恢復(fù)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，使聽力得以恢復(fù)［17］。本研究根據(jù)針灸的“治未病”思想［18］，以針刺耳周腧穴防治老年性聾。聽宮為手太陽小腸經(jīng)之穴，其經(jīng)脈入耳中，翳風(fēng)為手少陽三焦經(jīng)之穴，其經(jīng)脈沿耳后入耳中，出耳前；根據(jù)現(xiàn)代解剖學(xué)，聽宮穴有顳淺動(dòng)脈的耳前支，有耳顳神經(jīng)分布，深部有顳淺動(dòng)脈出發(fā)處，翳風(fēng)穴下布有耳大神經(jīng)、耳顳神經(jīng)、頸外動(dòng)脈、靜脈及迷走神經(jīng)等［19］，故針刺聽宮、翳風(fēng)穴，可激發(fā)經(jīng)氣，疏通耳部經(jīng)絡(luò)，增強(qiáng)耳脈氣血的運(yùn)行，平衡陰陽，調(diào)整內(nèi)耳功能。另外，針刺能提高聽神經(jīng)以及外側(cè)丘系橋腦的興奮性和傳導(dǎo)性、增強(qiáng)皮層對(duì)聲音感受的代償能力，從而改善聽功能［20］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，針刺聽宮、翳風(fēng)二穴可明顯改善豚鼠的聽功能，表明針刺聽宮、翳風(fēng)穴位，可能通過增加耳蝸和聽覺中樞的血流量、改善聽覺中樞神經(jīng)元的新陳代謝、提高蝸神經(jīng)和各級(jí)聽覺中樞的興奮性和傳導(dǎo)性，提高皮層對(duì)聲音信息的利用，從而延緩年齡相關(guān)性聽力損失的發(fā)生。但其具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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