進行性非綜合征型聾家系臨床表型及遺傳學分析＊

李征玥 程靜 盧宇 張旭 金占國 賈婧杰 袁慧軍

耳聾是導致言語交流障礙的常見疾病，是最常見的出生缺陷。每500個新生兒中就有1個出現(xiàn)雙側聽力損失≥40dB的永久性感音神經性聾；到青春期，這一比例上升到3.5／1000［1］。遺傳原因在耳聾致病因素中占60%，絕大部分病例為遺傳和環(huán)境等多因素共同作用的結果［2］。

由遺傳因素引起的耳聾可分為綜合征型（約30%）和非綜合征型（NSHL，約70%）。在非綜合征型聾中，按照耳聾的遺傳方式，可以分為常染色體顯性遺傳（DFNA，約70%）、常染色體隱性遺傳（DFNB，約15% ～20%）、X 染色體連鎖遺傳（DFNX，約1%）、Y 染色體連鎖遺傳（DFNY）及線粒體突變（兩者小于1%）［2～4］。目前常染色體顯性遺傳性非綜合征型聾的致病基因已經排序到DFNA64，定位了54 個DFNA 基因位點（http：／／hereditaryhearingloss.org）。本研究應用微衛(wèi)星標記對一個DFNA 家系的22個位點23個基因進行篩查，現(xiàn)將該家系的臨床表型及遺傳學特征報告如下。

1 資料與方法

1.1 家系資料 先證者來自中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科門診，通過對該耳聾患者的追蹤調查獲得一個五代的耳聾家系，該家系位于河南省范縣。根據解放軍總醫(yī)院分子診斷中心的聾病資料庫編號，該家系命名為HN－Z50。2010 年6月解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉科研究所聾病分子診斷中心家系采集小組到家系成員居住地對此家系進行了詳實的家系資料調查。現(xiàn)存家系成員44人，其中因在外地打工而未獲得家系資料5人，參加本研究的39名家系成員均簽署了知情同意書并進行了全身各系統(tǒng)的檢查及粗略的智力評估和聽力學檢查，以排除綜合征型聾。抽取相關成員的外周靜脈血5～10ml，用于基因組DNA 的提取及保存。該項目的倫理論證由解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 臨床聽力學檢測 應用Madsen 502 便攜式聽力計（丹麥），EAR3A 插入式耳機（美國）進行家系成員的純音測聽，測試雙耳125～8 000 Hz的氣骨導聽閾。應用Madsen 901（丹麥）聲導抗檢測儀進行聲導抗檢查，了解中耳狀況。先證者在解放軍總醫(yī)院進行了畸變產物耳聲發(fā)射、聽性腦干反應、前庭功能及顳骨CT 檢查。

1.3 耳聾表型的判斷標準 本研究的耳聾表型分析判斷標準參照《關于非綜合征型遺傳性聾家系遺傳學及聽力學描述術語建議案》［5，6］：①根據是否伴有全身其他器官系統(tǒng)的異常分為非綜合征型聾、綜合征型聾；②根據聽力損失的性質分為傳導性聾、感音神經性聾及混合性聾；③根據語言發(fā)育階段分為語前聾、語后聾；④根據聽力損失的頻率分為：高頻聽力損失型（2～8kHz聽力下降為主），中頻聽力損失型（0.5～2kHz聽力下降為主），低頻聽力損失型（0.25～0.5kHz聽力下降為主），全頻聽力損失型（0.25～8kHz聽力下降）；⑤聽力損失程度按照兩耳中聽力較好一耳的平均聽閾（0.5～4kHz聽閾的平均值）評估：20～40dB HL為輕度聽力損失，41～70dB HL為中度聽力損失，71～95dB HL 為重度聽力損失，＞95dB HL為極重度聽力損失。

1.4 已知DFNA 遺傳位點篩查 查詢DFNA 位點中已克隆的19個耳聾基因位點在染色體特定區(qū)域的物理距離（http：／／genome.ucsc.edu／），并在http：／／www.marshfieldclinic.org／research／pages／index.aspx中選取與與基因物理距離相近的微衛(wèi)星標記1～2 個，對每個微衛(wèi)星標記的上游引物5’端用FAM 熒光染料標記（引物由上海英俊生物技術有限公司合成）。應用ABI veriti熱循環(huán)儀進行PCR 反應，PCR 反應體系為5 μl（包含1 μgDNA，每對引物各0.05μl，0.5μl 10xbuffer，0.3 μl Mg2＋，0.8μl dNTP，1μl Q solution，0.05μl的Hotstar Taq DNA 聚合酶，雙蒸餾水補至5μl），反應條件采用“Touchdown”方式，用ABI 3130xl Genetic Analysis測序儀進行PCR 擴增產物的變性和上樣，GeneMaker（version 1.65）軟件進行微衛(wèi)星標記分析。分析結果輸入LINKAGE DESIGNER軟件得到＊.pre、＊.dat、＊.mdf相關參數文件，采用LINKAGE（5.1version）軟件進行連鎖分析，并計算LOD 值。LOD 值＞1 支持連鎖，LOD 值≥3提示肯定連鎖，－2＜LOD 值＜3 提示可能連鎖需增加家系材料，LOD 值＜－2提示不連鎖［7］。

2 結果

2.1 HN－Z50家系的聽力學診斷及病史 39 人中，16人診斷為雙側感音神經性聾，耳聾患者年齡最大76歲（II：3），最小17 歲（IV：17）。除IV：10外，余15名患者均表現(xiàn)為遲發(fā)性語后漸進性聽力損失，伴雙側高頻耳鳴，發(fā)病年齡14～40歲，早期以中頻聽力下降為主，隨著年齡增加，逐漸累及全頻，呈下降型聽力曲線，無眩暈及耳毒性藥物應用史。IV：10表現(xiàn)為先天性聽力損失，不會說話，自幼有多次氨基糖苷類藥物應用史，無耳鳴。所有患者全身其他系統(tǒng)均未見異常。

2.2 HN－Z50家系典型耳聾患者臨床聽力學特征分析 圖1為先證者IV：7的聽力圖。女，27歲，足月順產，出生后對聲音反應良好，學語正常，18歲時出現(xiàn)雙耳聽力下降并伴有雙側高頻耳鳴，此后自覺聽力下降程度逐漸加重，無眩暈等其他伴隨癥狀，無高血壓、糖尿病等疾病。雙耳各頻率均未引出DPOAE，聽性腦干反應檢查示雙側I－V 波間期正常，前庭功能檢查正常。顳骨CT 掃描示中耳及內耳結構正常，純音測聽示中高頻聽力損失為主，聽力曲線為覆盆型，聽力損失程度為中度。

圖2為III：12 聽力圖。男，43歲，為家系中第三代成員，語言能力好。16歲時出現(xiàn)雙耳聽力下降并伴有雙耳高頻間斷性耳鳴，自覺聽力下降逐年加重；無眩暈，無噪聲接觸史，無高血壓、糖尿病、心腦血管疾病史；純音測聽顯示為全頻聽力下降，聽力曲線呈陡坡型，聽力損失程度為重度。

圖3為II：3聽力圖。女，76歲，為家系患病成員中年齡最大者，語言能力好。12歲時出現(xiàn)雙耳高頻耳鳴，25歲出現(xiàn)聽力下降，無眩暈等其他伴隨癥狀；純音測聽示全頻聽力損失，以中高頻聽力下降為主，聽力曲線呈陡坡型，聽力損失程度為極重度。

圖4為IV：10聽力圖。男，22 歲，出生時父母發(fā)現(xiàn)其對聲音反應較常人差，至今不會說話，幼年時有多次耳毒性藥物應用史，自覺聽力無明顯變化，無耳鳴、眩暈等其他癥狀，智力正常。

2.3 HN－Z50家系遺傳學特征分析 應用Cyril－lic2.1軟件根據家系調查及檢查結果繪制家系譜圖（圖5），可見，該家系共5代，各代連續(xù)發(fā)病，現(xiàn)存患者分布于第2～4代，男女均可發(fā)病，男女患者比例為11∶7。家系中最初患者為男性（I：1）；第II代有3人，共2人患病，患病率為66.67%（2／3）；第III代為10人，未獲得家系資料1人，余9人中8人為耳聾患者，患病率為88.89%（8／9）；第IV 代共21人，未獲得家系資料4人，余17人中7人純音測聽顯示聽力下降，患病率41.18%（7／17）；第V 代共1人，聽力正常。第IV、V 代患病率下降，可能原因為家系成員尚年輕，未到發(fā)病年齡，暫未表現(xiàn)出耳聾、耳鳴癥狀。除IV：10外，所有耳聾患者均表現(xiàn)為語后進行性聽力損失，伴雙側高頻耳鳴，IV：10考慮可能為非家系致聾基因導致的耳聾。由此可見，HNZ50家系符合典型的常染色體顯性遺傳特點。

圖1 先證者IV：7 雙耳聽力圖（女，27歲）圖2 患者III：12 雙耳聽力圖（男，43歲）圖3 患者II：3 雙耳聽力圖（女，76歲）圖4 患者IV：10 雙耳聽力圖（男，22歲）

圖5 HN－Z50家系系譜圖

2.4 HN－Z50家系微衛(wèi)星標記篩查結果 HNZ50家系22 個DFNA 位點的23 個已知常染色體顯性遺傳性聾致病基因附近的微衛(wèi)星遺傳標記連鎖分析結果如表1所示，除DFNA5的兩個遺傳標記LOD值分別為2.08和1.89，不否定連鎖外，其余耳聾基因附近的遺傳標記LOD值均＜－2，否定連鎖。

2.5 HN－Z50家系部分成員DFNA5基因篩查結果 分別取家系中2名患者（II：3、III：7）及2名正常人（II：5、III：16）進行DFNA5基因全部外顯子測序，均未發(fā)現(xiàn)突變。

表1 22個DFNA 位點的20個遺傳標記及LOD值

3 討論

本研究中HN－Z50家系耳聾家系圖譜分析表明，該家系的耳聾遺傳方式表現(xiàn)為典型的孟德爾常染色體顯性遺傳。根據患者病史及聽力圖可得出，該家系為語后聾，聽力下降程度呈進行型，發(fā)病早期以中頻聽力下降為主，聽力曲線為覆盆型，下降程度為輕中度，此后逐漸累及高頻，隨著年齡的增長，呈全頻聽力下降，聽力曲線呈陡坡型，下降程度至極重度。

但該家系有一名耳聾患者IV：10情況特殊，需要鑒別。IV：10患者無語言能力，能正常發(fā)音，無智力異常，表明其發(fā)病年齡在學語階段或學語前。雖然患者有多次耳毒性藥物應用史，但都在學語后，考慮與其耳聾原因無關。而該家系其他耳聾患者發(fā)病年齡均在語言形成之后，與IV：10不一致，由此推測IV：10耳聾的原因可能并非該家系的致聾基因引起，而可能是其他耳聾基因。

迄今為止，已報道的非綜合征型耳聾基因位點已達到166 個，包括DFNA64 個，DFNB95 個，DFNX6 個，DFNY1 個（http：／／hereditaryhearingloss.org），其中已克隆的DFNA 基因有23 個。DFNA 型耳聾基因型和表型存在著一定的因果關系，在已定位的DFNA 位點中，以低頻聽力損失為主的有：DFNA1、DFNA6／14／38、DFNA7／54、DFNA57；以中頻下降為主的有：DFNA10、DFNA13、DFNA8／12；以高頻聽力下降的，有：DFNA2、DF－NA3、DFNA4、DFNA5、DFNA7、DFNA9、DFNA11、DFNA15、DFNA16、DFNA17、DFNA18、DFNA19、DFNA20／26、DFNA21、DFNA22、DFNA23、DFNA25、DFNA27、DFNA28、DFNA30、DFNA31、DFNA34、DFNA36、DFNA37、DFNA39、DFNA41、DFNA42、DFNA44、DFNA48、DFNA53、DFNA58、DFNA59、DFNA64；以全頻聽力下降或語前聾的有：DFNA24、DFNA32、DFNA43、DFNA47、DFNA49、DFNA57、DFNA59。

目前在進行常染色體顯性遺傳性聾家系基因定位研究中最常用的方法為：①對已克隆的表型相似的基因直接測序或STR 遺傳標記計算LOD 值，排除已知的DFNA 基因；②對已克隆的表型不同的基因直接測序或STR 遺傳標記計算LOD 值，排除已知的DFNA 基因；③應用其他方法定位新的常染色體顯性遺傳性聾基因［8］。

與本研究家系HN－Z50 相關的基因有DFNA10（EYA4）、DFNA13（COL11A2）、DFNA8／12

（TECTA）。EYA4基因位于6q22.3，共有21個外顯子，cDNA 全長1920bp，編碼639個氨基酸，屬于eya基因家族的一員，是調節(jié)眼部發(fā)育和Corti器功能成熟的關鍵基因［9］。1996年由O＇Neill等［10］在美國和比利時的DFNA10家系中發(fā)現(xiàn)該基因突變可以引起常染色體顯性遺傳性聾，主要表現(xiàn)為語后、以中頻下降為主的感音神經性聾，后期可累及全頻。

COL11A2位于6p21.3，含有66 個外顯子，長28 000bp，主要在軟骨中表達［11］。該基因突變可以引起DFNA13，主要為中頻聽力損失。電子顯微鏡下顯示干擾Col11a2表達的小鼠蓋膜組織存在膠原纖維的損失，內耳存在超微結構畸形導致蓋膜異常，這可能是其導致聽力損失的原因之一［12］。

TECTA 基因是Kirschhofer［13］1998年在一個澳大利亞耳聾家系中首次發(fā)現(xiàn)，定位在11q23～q25，包含23個外顯子，全長6 466bp。TECTA 編碼alpha—tectorin 蛋白是分布于耳蝸蓋膜的一種主要的非膠原成分。聲音傳到耳蝸后，首先要引起前庭膜和蓋膜的振動，才能引起毛細胞的興奮，所以蓋膜在聲音傳導的過程中起著重要的作用。該基因突變可以導致中頻中重度聽力損失。

本研究對與HN－Z50家系表型相似的上述3個位點的基因及其他19個位點的20個基因進行了連鎖分析篩查，結果顯示，除DFNA5外，其余位點均否定連鎖。為了確定家系致病基因是否為DFNA5，應對家系中所有成員進行DFNA5全外顯子測序，但為了節(jié)約成本，首先選取了家系中診斷明確的2名患者及2名正常人進行測序，結果表明，II：3、III：7、II：5、III：16DFNA5 基因全外顯子均無突變，由此可排除DFNA5為該家系致聾基因。

對HN－Z50家系的研究策略首先為判斷該家系是否與已知的DFNA 位點連鎖，如不連鎖，則提示可能為一新的耳聾位點。本研究應用微衛(wèi)星標記連鎖分析及直接測序的方法篩查了DFNA22個位點的23個基因，結果均為陰性。

新一代測序技術（next－generation sequencing technology，NGS）的主要原理是在芯片上固定大量被測的模板DNA 片段，其上雜交結合通用的DNA引物，應用不同的方法產生上百萬甚至更多的單分子多拷貝PCR 克隆陣列，隨后進行引物雜交及酶的延伸。該技術的特點是一次可以讀取分析最多幾百萬條DNA 序列，相對成本較低，節(jié)省時間，這是傳統(tǒng)的測序技術不能達到的。NGS目前已經成為耳聾致病基因研究首選工具，2010年Rehman［14］等利用NGS對一個常染色體隱性遺傳性聾家系進行了分析，將致病基因定位在了染色體9q34.3的2.9Mb區(qū)域內，經過計算機分析，找到了該家系的致病基因TPRN；同年，Shearer［15］等對已經通過傳統(tǒng)Sanger Sequencing確診的9名遺傳性聾患者進行NGS測序，結果一致，由此也證明了NGS的可靠性。因此，下一步將通過NGS對該家系成員進行全外顯子測序，找尋致病基因。

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