miR－18a 對(duì)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成能力的影響

莫 倩， 李 丹， 凌文華

(中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)系，廣東 廣州510080)

血管生成(angiogenesis)是指血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)遷移、增殖、管腔形成與基質(zhì)重塑等產(chǎn)生新生毛細(xì)血管網(wǎng)的過(guò)程［1］。修復(fù)性血管生成主要發(fā)生在傷口的愈合與缺血性損傷，而病理性血管生成有助于腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并與關(guān)節(jié)炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變等有關(guān)［2］。

MicroRNA 是一類由19 ～25 個(gè)核苷酸組成的非編碼小分子RNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控參與了人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。miR－17 ～92 家族屬于多順?lè)醋蛹易澹渲邪╩iR－17、miR－18a、miR－19a、miR－20a、miR－19b－1 和miR－92a。目前的研究多集中于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抗凋亡以及促進(jìn)腫瘤組織血管生成等方面［3］，對(duì)miR－17、miR－20 和miR－92a 的報(bào)道較多，而關(guān)于miR－18a 的報(bào)道較少，特別是其對(duì)正常動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成功能的調(diào)節(jié)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。故本研究采用體外人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(human aortic endothelial cells，HAECs)血管生成模型，探討miR－18a 不同表達(dá)水平對(duì)血管生成功能的調(diào)節(jié)作用，從而為miR－18a 作為血管性疾病的基因治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Sciencell;0.25%胰酶、人纖維黏連蛋白和人血清白蛋白購(gòu)自Sigma－Aldrich;Matrigel 購(gòu)自Becton Dickinson;miR－18a mimics 和inhibitor 由GenePharma 合成;LipofectamineTM2000 和Trizol 購(gòu)自Invitrogen;mirVanaTMqRT－PCR miRNA Detection Kit 購(gòu)自Applied Biosystems。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HAECs 購(gòu)自Sciencell，細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原染色陽(yáng)性。細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(endothelial cell medium，ECM)添加5%胎牛血清、1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和青霉素(1 × 105U/L)/鏈霉素(100 mg/L)及5% CO2、37 ℃條件下常規(guī)培養(yǎng)。

2.2 轉(zhuǎn)染 細(xì)胞傳代至第3 代時(shí)，胰酶消化后取3×105個(gè)細(xì)胞至6 孔板培養(yǎng)12 h。利用LipofectamineTM2000 分別將10 nmol/L miR－18a mimics 和20 nmol/L miR－18a inhibitor 轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，轉(zhuǎn)染物序列見(jiàn)表1。

表1 轉(zhuǎn)染物序列Table 1. The sequences of transfection complexes

2.3 總RNA 提取 miR－18a mimics 或inhibitor轉(zhuǎn)染48 h 后，棄去培養(yǎng)基，PBS 清洗2 次后加入1 mL Trizol，反復(fù)吹打后室溫放置5 min。加入200 μL 氯仿，劇烈振蕩15 s 后室溫放置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取上層水相約500 μL 于1.5 mL EP 管，加入500 μL 異丙醇，充分混勻，室溫放置10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min。棄上清液，加入1 mL 預(yù)冷的75%乙醇，渦旋混勻，4 ℃、7 500 r/min離心5 min。棄上清液，室溫晾干5 min，加入0.1%焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)處理的雙蒸水適量溶解RNA，－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 qRT－PCR 檢測(cè) miR－18a mimics 或inhibitor 轉(zhuǎn)染48 h 后Trizol 提取總RNA，TaqMan qRT－PCR 檢測(cè)miR－18a 表達(dá)。每個(gè)樣本取1 ng RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)定反應(yīng)條件:16 ℃30 min，42 ℃30 min，85 ℃5 min。PCR 按照試劑盒操作指南進(jìn)行，反應(yīng)條件:95 ℃10 min，40 個(gè)循環(huán):95 ℃15 s，60 ℃1 min。U6 為內(nèi)參照基因。miR－18a 引物序列:5＇－UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG－3＇。U6 引物序列:5＇－GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCATATTTT－3＇。

2.5 Transwell 小室遷移實(shí)驗(yàn) Transwell 小室用2.5 mg/L 人纖維黏連蛋白預(yù)包被45 min。24 孔板中加入800 μL ECM 培養(yǎng)基并將Transwell 小室放入孔中。miR－18a mimics 或inhibitor 轉(zhuǎn)染48 h 后胰酶消化細(xì)胞，無(wú)血清ECM 培養(yǎng)基重懸后將5 ×104個(gè)細(xì)胞接種至預(yù)包被的Transwell 小室。37 ℃培養(yǎng)6 h 后4%多聚甲醛固定，蘇木素染色后倒置顯微鏡計(jì)數(shù)遷移至微孔膜下層的細(xì)胞數(shù)目。每個(gè)樣本隨機(jī)計(jì)數(shù)5 個(gè)視野。

2.6 體外黏附力實(shí)驗(yàn) 96 孔板用2.5 mg/L 人纖維黏連蛋白預(yù)包被2 h 后1%人血清白蛋白封閉1 h。miR－18a mimics 或inhibitor 轉(zhuǎn)染48 h 后胰酶消化細(xì)胞，無(wú)血清ECM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種2 ×104個(gè)細(xì)胞至預(yù)包被的96 孔板中，每組平行5 個(gè)樣本。37 ℃培養(yǎng)1 h 后4%多聚甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色后每孔加入100 μL 1%醋酸乙醇振蕩10 min，570 nm 處測(cè)定吸光度值。

2.7 毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn) 96 孔板每孔加入50 μL Matrigel，37 ℃包被30 min。miR－18a mimics 或inhibitor 轉(zhuǎn)染48 h 后胰酶消化細(xì)胞，ECM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種細(xì)胞(每孔5 ×104個(gè))至預(yù)包被的96 孔培養(yǎng)板中。37 ℃培養(yǎng)24 h 后4%多聚甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色。隨機(jī)選取5 個(gè)視野，倒置顯微鏡計(jì)數(shù)由內(nèi)皮細(xì)胞圍成完整的毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 內(nèi)皮細(xì)胞miR－18a 的表達(dá)

與對(duì)照組相比，miR－18a mimics 轉(zhuǎn)染組miR－18a 表達(dá)量增加608 倍，見(jiàn)圖1A;miR－18a inhibitor轉(zhuǎn)染組miR－18a 表達(dá)量下降69%，見(jiàn)圖1B，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2 體外內(nèi)皮細(xì)胞血管生成功能檢測(cè)

2.1 Transwell 小室遷移實(shí)驗(yàn) miR－18a mimics 轉(zhuǎn)染組內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力與mimics NC 組相比降低60%(P ＜0.01)，見(jiàn)圖2A。miR－18a inhibitor 轉(zhuǎn)染組遷移能力是對(duì)照組的2 倍，見(jiàn)圖2B，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

Figure 1. The expression level of miR－18a in human aortic endothelial cells after transfected with miR－18a mimics (A)or inhibitor(B). ±s.n=3. * P ＜0.05 vs negative control (mimics NC or inhibitor NC).圖1 轉(zhuǎn)染miR－18a mimics 或inhibitor 后HAECs miR－18a 的表達(dá)水平

Figure 2. The migration capacity of human aortic endothelial cells after transfected with miR－18a mimics (A)or inhibitor (B)(hematoxylin staining，×200). ±s.n=5. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs negative control (mimics NC or inhibitor NC).圖2 轉(zhuǎn)染miR－18a mimics 或inhibitor 后HAECs 的遷移能力

2.2 體外黏附力實(shí)驗(yàn) 與對(duì)照組相比，miR－18a mimics 轉(zhuǎn)染組黏附能力無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖3A;miR－18a inhibitor 轉(zhuǎn)染組黏附能力增加43%，見(jiàn)圖3B，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

Figure 3. The adhesion capacity of human aortic endothelial cells after transfected with miR－18a mimics (A)or inhibitor (B). ±s.n=5. * P ＜0.05 vs inhibitor NC.圖3 轉(zhuǎn)染miR－18a mimics 或inhibitor 后HAECs 的黏附能力

2.3 體外毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染miR－18a mimics 組管腔樣結(jié)構(gòu)數(shù)量比對(duì)照組減少52%，見(jiàn)圖4A、C;miR－18a inhibitor 轉(zhuǎn)染組管腔數(shù)量與對(duì)照組相比增加84%，見(jiàn)圖4B、D，差異顯著(P＜0.01)。

Figure 4. The capillary－like tube formation ability of human aortic endothelial cells after transfected with miR－18a mimics (A)or inhibitor (B)(crystal violet staining，×100). ±s.n=5. ＊＊P ＜0.01 vs negative control (mimics NC or inhibitor NC).圖4 轉(zhuǎn)染miR－18a mimics 或inhibitor 后HAECs 的毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成能力

討 論

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染miR－17 ～92 家族中miR－18a 的mimics 和inhibitor 至人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，觀察miR－18a 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的影響。結(jié)果顯示，miR－18a mimics 轉(zhuǎn)染后可抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管腔形成能力;而miR－18a inhibitor 則對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞血管形成有促進(jìn)作用，尤其是對(duì)管腔形成能力作用明顯。以上研究結(jié)果表明，對(duì)于主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞而言，miR－18a過(guò)表達(dá)具有抑制血管生成的作用。目前關(guān)于miR－18a 對(duì)血管生成功能的研究報(bào)道較少，但Bonauer 等［4］關(guān)于miR－18a 同家族成員miR－92a 的研究結(jié)果支持我們的研究，他們?cè)隗w內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)人內(nèi)皮細(xì)胞中miR－92a 過(guò)表達(dá)可抑制血管生成，而在鼠肢端缺血模型和心梗模型中采用antagomir 抑制miR－92a 表達(dá)則可增加血管生成，促進(jìn)受損組織的功能恢復(fù)。此外，Doebele 等［5］最新發(fā)表的數(shù)據(jù)亦顯示，miR－17、－18a 及－20a 顯著抑制體外三維細(xì)胞球狀體萌芽模型的血管生成。

miR－18a 對(duì)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的作用機(jī)制目前尚不清楚，通過(guò)microRNA 靶基因預(yù)測(cè)軟件篩選及相關(guān)文獻(xiàn)的檢索，我們認(rèn)為在血管生成過(guò)稱中參與細(xì)胞基質(zhì)降解、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、管腔形成的多個(gè)細(xì)胞因子或者酶類都可能是包括miR－18a 在內(nèi)的miR－17 ～92 家族潛在的直接分子靶或者靶信號(hào)通路下游的效應(yīng)分子。如TGF－β/Smad 信號(hào)通路的上游受體及下游轉(zhuǎn)錄因子已被證實(shí)為miR－18a等miR－17 ～92 家族成員的分子靶［6－7］。此外，VEGF［8］、HIF－1A［9］、JAK1［5］、integrins［4］等這些促血管生成的關(guān)鍵分子也被證實(shí)是miR－18a 等miR－17 ～92 家族成員的直接靶分子。并且，miR－18a等miR－17 ～92 家族成員還廣泛參與細(xì)胞周期、增殖和凋亡的調(diào)控［3］。究竟miR－18a 調(diào)控血管生成過(guò)程中哪些分子或者信號(hào)通路起關(guān)鍵性介導(dǎo)作用?尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

關(guān)于miR－17 ～92 家族對(duì)血管生成及對(duì)腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的影響，一直存在較大爭(zhēng)議。miR－17 ～92家族曾一度被認(rèn)為是促癌的microRNA，即oncomiR［3］，因?yàn)樽畛醯暮芏嘌芯堪l(fā)現(xiàn)其在腫瘤中高表達(dá)并可促進(jìn)腫瘤的增殖和血管生成，比如可通過(guò)下調(diào)抗血管生成因子TSP－1 及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤組織的血管生成［10］。最新幾項(xiàng)研究證實(shí)，miR－17 ～92 家族成員對(duì)體外正常內(nèi)皮細(xì)胞血管生成模型以及缺血或梗死整體的動(dòng)物模型具有抑制血管生成作用［4－5］。我們推測(cè)這種完全相反的研究結(jié)果可能與所用研究模型即所采用的細(xì)胞或者血管生成所處的大環(huán)境密切相關(guān)。不同的病理、生理狀況下miR－17 ～92 家族成員的活性及調(diào)控機(jī)制可能并不完全相同。有研究發(fā)現(xiàn)miR－17 ～92 家族中的miR－17 和miR－20a，對(duì)于生理性血管再生模型和病理性的腫瘤血管生成模型表現(xiàn)出不同的效應(yīng)［5，11］。對(duì)于腫瘤細(xì)胞，miR－17 ～92 家族成員增加了其旁分泌的促血管生成物質(zhì)的活性，這可能削弱了其對(duì)于正常內(nèi)皮細(xì)胞的抗血管生成作用［5］。

血管生成過(guò)程是由促血管生成和抗血管生成信號(hào)平衡嚴(yán)格調(diào)控。而miR－18a 對(duì)血管生成的調(diào)控作用及其機(jī)制還并不十分清楚?，F(xiàn)有的腫瘤血管生成模型與生理狀況下的血管生成模型中miR－17 ～92 家族相反的調(diào)控效應(yīng)需進(jìn)一步深入研究。因?yàn)椴煌谋尘跋峦ㄟ^(guò)miR－18a 等miR－17 ～92 家族的靶向作用調(diào)節(jié)血管生成可能具有不同的意義，一方面誘導(dǎo)血管生成可改善血管閉塞性疾病引起的缺血性損傷;而另一方面，抑制血管生成被證明是抑制腫瘤生長(zhǎng)的可行策略。

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