健康雙生子外周血CD4 + 和CD8 + T 細胞亞群相對計數遺傳度研究

嚴 愷 魏 欣 董 菊 蔡文萍 孫 荷 石小翔 李 雁 侯 紅 嚴衛(wèi)麗

已有證據表明如病毒感染［1，2］、自身免疫性疾?。?］等環(huán)境因素可影響CD4+、CD8+T 細胞的數量及功能變化，當然也伴隨作用于淋巴細胞的生成及發(fā)展的遺傳因素［4］。結合環(huán)境與遺傳因素考慮，雙生子研究可被用來定量估計影響表型的遺傳及環(huán)境效應大小。Hall 等［5］于2000 年針對成年健康人群研究得出了CD4+、CD8+T 細胞的遺傳度，同時認為加性遺傳效應對成年人群CD4+、CD8+T 細胞亞群數量有著重要影響。隨后該團隊又在2002 年選取不同染色體上的基因位點進一步證實了先前的研究結論，即發(fā)現這些基因與CD4+和CD8+T 細胞的數量或功能變化存在關聯［6］。因機體感染可能引起體內T 細胞數量的波動［1］，Clapperton 等［7］選擇在無病原體級環(huán)境下飼養(yǎng)的健康豬群進行研究，以普通級環(huán)境下飼養(yǎng)的豬群作為對照，觀察無病原體環(huán)境下豬群的免疫狀況。在無病原體影響下計算得到的豬淋巴細胞遺傳度可能更趨于真實，因此針對健康人群的CD4+、CD8+T 細胞遺傳度的研究更為有意義。關于幼兒人群的淋巴細胞遺傳度研究，國內外尚未見相關報道。本文基于雙生子研究，應用Mx 軟件及構建結構方程模型的方法，來探討幼兒雙生子人群CD4+、CD8+T細胞的遺傳度，定量分析影響CD4+和CD8+T 細胞的遺傳和環(huán)境效應。

1 方法

1.1 樣本量計算 本研究是以滿1 周歲雙生子為研究對象的經典雙生子研究，探索導致幼兒外周血CD4+和CD8+T 細胞相對計數變化的遺傳和環(huán)境因素。樣本量及把握度計算通過Mx 軟件(Michael C. Neale，Department of Psychiatry，Virginia Institute for Psychiatric and Behavioral Genetics，Virginia Common Wealth)完成。按照α =0. 05、β=0.80 計算，參考國外報道成年人群CD4+和CD8+T 細胞的遺傳度40% ～60%［5，6］，所需樣本量為29 對雙生子，但因本研究選取的人群為剛年滿1 周歲的幼兒雙生子人群，并且考慮到樣本中含有漢族和維吾爾族，與既往研究不同，故保守估計遺傳度僅為0.3 的情況下，所需樣本量為135 對雙生子。

1.2 收集樣本醫(yī)院和時間 為保證納入雙生子研究對象能達到樣本量需要，選擇了新生兒年出生數量居新疆烏魯木齊市前5 位的醫(yī)院(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院、烏魯木齊市婦幼保健醫(yī)院、新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院、中國人民解放軍烏魯木齊總醫(yī)院和烏魯木齊市第一人民醫(yī)院)作為研究現場。估測上述5 所醫(yī)院新生兒年出生數量，樣本收集時間應持續(xù)2 年。

1.3 納入標準 ①2009 年3 月1 日至2011 年3 月1 日出生的雙生子;②父母民族同為漢族，或同為維吾爾族;③孕期保健，孕婦分娩，雙生子生后1、3、6 個月和1 周歲時體格生長(身高、體重、胸圍、頭圍)等指標評估，雙生子1 周歲時撫養(yǎng)情況調查均在研究現場完成;④出生時已按0-1-6方案全程接種乙肝疫苗者;⑤雙生子同時參加1 周歲生長發(fā)育體檢。

1.4 排除標準 ①雙生子中僅存留一子或均未存活者;②無法與納入對象直系親屬取得聯系者;③接種疫苗產地、類型或劑量未依據中國計劃免疫方案執(zhí)行(如采用非衛(wèi)生部統(tǒng)一配備的進口疫苗、非常規(guī)重組酵母乙肝疫苗、超過常規(guī)注射劑量);④研究對象直系親屬不愿參加體檢者;⑤父母有乙肝感染史;⑥研究對象出生時病案中提示出生缺陷者;⑦1 周歲內患重大疾病且未愈者;⑧1 周歲體檢時處患病狀態(tài)者。

1.5 醫(yī)學倫理 本研究于立項前已通過新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查。所有研究對象在1 周歲體檢時向其父母說明研究目的及內容，并征得其父母親(一方或雙方)的同意，由父母親代研究對象決定是否參加本研究。

1.6 問卷調查 問卷包括7 部分，①一般情況:雙生子出生序列、性別、出生日期和民族等;②母親孕期狀況:末次月經時間、孕次、血型和體重增加狀況等;③母親分娩狀況:麻醉方式、分娩方式和產程、剖腹產原因和產后出血狀況等;④雙生子出生時信息:健康狀況、體重和身高等;⑤雙生子生長發(fā)育狀況:1、3、6 個月及1 周歲時的體重和身高等;⑦雙生子1 周歲內撫養(yǎng)情況:喂養(yǎng)方式、母乳喂養(yǎng)時間、撫養(yǎng)環(huán)境、患病史和輔食攝入時間等。其中一般情況、母親分娩狀況和雙生子出生時狀況等信息來源于各個醫(yī)院在檔病案，由經統(tǒng)一培訓的調查員填入問卷。母親孕期狀況及雙生子生長發(fā)育狀況等信息在研究對象滿1 周歲體檢時由研究人員對母子保健本上信息進行登記或面對面的詢問方式獲得。

1.7 體格檢查 根據“1995 年中國九市7 歲以下兒童體格發(fā)育調查研究”方法測量身長、體重、頭圍和胸圍［8］，身長采用上海金羊衡器廠生產的臥式標準測量床，讀數精確至0.1 cm;體重采用最大載重為15 kg 的上海金羊嬰幼兒專用杠桿式磅秤，以kg 為單位，讀數精確至0.1 kg;頭圍和胸圍采用軟尺測量，讀數均精確至0.1 cm。

1.8 實驗室檢測 使用真空負壓EDTA-K3 抗凝管采集雙生子新鮮全血2 mL，于當日送新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院科研中心流式細胞實驗室測定CD4+和CD8+T 細胞相對計數。

1.8.1 主要材料與儀器 針對淋巴細胞表面分化抗原不同選擇不同熒光素標記的單克隆抗體:CD4 異硫氰酸熒光素(FITC)標記的小鼠抗人單克隆抗體(批號IM0448U，克隆號13B8.2)，8℃保存;CD8 藻紅蛋白(PE)標記的小鼠抗人單克隆抗體(批號IM0452U，克隆號B9.11)，8℃保存;溶血素為OPtilyse?C 免洗紅細胞裂解試劑(A11894)，常溫下保存，均由美國Beckman-Coulter 和法國Immunotech SAS 公司生產。Coulter 流式細胞儀專用IsoFlow 鞘液和Coulter Clenz 清洗液(美國Beckman-Coulter 公司)。EPICS-Altra?四色流式細胞儀及其配套的計算機軟件數據處理系統(tǒng)，帶自動進樣裝置及配套數字信號處理技術(美國Beckman-Coulter?公司)。

1.8.2 實驗步驟 使用直接免疫熒光標記全血溶血法，測定研究樣本外周血淋巴細胞及其亞群，按說明書操作。通過流式細胞儀分析應用Cell Quest 軟件熒光散點圖分別計數5 000 個淋巴細胞，標記出CD4+和CD8+T 細胞的百分率。

1.9 卵型鑒定 微衛(wèi)星DNA 基因分型技術由上海晶能生物公司實驗室完成。采用美國GentraDNA 提取試劑盒，從EDTA 抗凝血中提取 DNA;使用 ABI 公司的AmpliTaqGoldRDNA 試劑盒，在ABI GeneAmpR9700 型PCR擴增儀上復合擴增15 個STR 位點(D3S1358、TH01、

D21S11、D18S51、Penta E、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、vWA、D8S1179、TPOX、FGA)以及性別標記Amelogenin;取擴增產物于ABI PRISMR3100 型DNA 遺傳分析儀上電泳，最后用GeneMapperR Versions 3.1軟件分析數據和自動分型，進行鑒定。每個微衛(wèi)星標記掃描的結果有兩個峰值，如為同卵純合子，兩個峰值應相同，反之為異卵雜合子。因此性別和15 個STR 位點基因型全部一致者判定為同卵雙生子(MZ)，而性別不同和(或)有一個或以上的位點基因型不同者判為異卵雙生子(DZ)。該方法卵型鑒定的可靠性達99.6%以上［9］。

1.10 統(tǒng)計學方法 雙生子的所有數據使用Access 2003數據庫軟件采取雙人雙機方式錄入，在錄入數據檢查核對無誤后進行邏輯核對，以確保原始數據錄入的準確性。應用Stata 11. 0 軟件(Stata Corp LP，College Station，TX，USA)對雙生子各組的一般信息和相關體型指標進行統(tǒng)計描述并進行相關性分析;應用Mx 軟件包構建結構方程模型，并計算遺傳度［10］。首先分別計算MZ、DZ 兩個同胞間待分析性狀的組內相關系數rMZ和rDZ，并進行比較，當rDZ≥1/2rMZ時擬合適用于ACE 模型，而相反當rDZ＜1/2rMZ時提示存在顯性遺傳作用，擬合應選用ADE 模型。采用Mx 軟件構建單一性狀的ACE 或ADE 模型，得到χ2、P、AIC(Akaike＇ s Information Criterion)和 RMSEA (Root Mean Squared Error Approximation)值等。其中，χ2值結合P 值來檢驗模型間差異的顯著性，當P ＞0.05 時表明擬合的兩者模型間差異無統(tǒng)計學意義，即兩者模型間都可視為相對穩(wěn)定。AIC 值＜0 表示達到了較好的擬合效果，而且AIC 越小擬合效果越好。RMSEA 值通過排除樣本量對擬合效果的影響來判斷擬合優(yōu)度，RMSEA ＜0.10 表明擬合較好，＜0.05 表明擬合非常好。最后，結合專業(yè)知識分析遺傳效應、共同環(huán)境效應及非共同環(huán)境效應各組分的作用，選擇出指標最佳并且合適的模型得到各通徑系數值及遺傳度，進而比較遺傳和環(huán)境因素對外周血CD4+和CD8+T 細胞的影響程度。

2 結果

2.1 雙生子一般情況 研究期間符合納入標準，并經過排除標準排除后進入分析的雙生子共172 對，其中MZ 82 對，DZ 90 對，男性84 對，女性52 對，性別互異43 對。父母雙方均漢族151 對，均為維吾爾族21 對。表1 顯示MZ 和DZ組一般特征比較差異均無統(tǒng)計學意義，CD4+T 細胞相對計數差異有統(tǒng)計學意義(P=0.049 0)，但兩組數值都在正常參考值范圍內，差異并無生物學意義，CD8+T 細胞和CD4+/CD8+T 細胞兩組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

2.2 CD4+、CD8+T 細胞亞群與圍生期、生長發(fā)育指標的相關性 表2 顯示，孕婦孕齡、孕期體重增加、Apgar 評分、母乳喂養(yǎng)時間和1 周歲時身高增長量與CD4+、CD8+T 細胞相對計數存在弱相關性，其中Apgar 評分在MZ 組和DZ組與CD4+T 細胞相對計數均呈弱正相關性(rMZ=0.16，rDZ=0.14，P ＜0.05)，其余指標均未能在兩組中同時出現顯著相關結果。

表1 雙生子一般特征和CD4 +、CD8 + T 細胞亞群狀況Tab 1 General characteristics and CD4 + and CD4 + T cell subsets of twins

表2 雙生子CD4 +、CD8 + T 細胞亞群與圍生期、生長發(fā)育指標的相關性(r，P 值)Tab 2 Correlations of CD4 + and CD8 + T cell subsets with perinatal period and growth variables for overall MZ and DZ twins(r，P value)

2.3 遺傳度全模型/子模型選擇及遺傳度計算 由于雙生子之間并非獨立樣本，在計算遺傳度之前，先將CD4+和CD8+T 細胞亞群數據以出生先后順序進行分組，經Shapiro-Wilk 正態(tài)性檢驗后，各組數據均符合正態(tài)分布(P ＞0.05)，可以用結構方程模型進行遺傳度擬合。CD4+T 細胞:rMZ=0.288 6，rDZ=0.232 6，且rDZ＞1/2rMZ，適用包括加性基因、共享環(huán)境和非共享環(huán)境的ACE 模型(全模型)及其嵌套模型(子模型)。CD8+T 細胞:rMZ=0. 090 4，rDZ=0.283 9，且rDZ＞1/2rMZ，其遺傳度計算選擇ACE 模型進行擬合。

表3 顯示，在CD4+T 細胞遺傳度模型擬合中，ACE、AE 模型擬合成功(RMSEA ＜0.1，P ＞0.05)，CE、E 模型并不符合擬合要求，未完成最佳擬合。ACE 和AE 模型間△χ2的比較差異無統(tǒng)計學意義(P =0.200)，提示在模型中剔除共同環(huán)境效應C 后對模型的擬合優(yōu)度無顯著影響?？紤]到AE 為精簡模型，故選擇AE 模型為最終擬合模型。由此得到CD4+T 細胞亞群的遺傳度為61.8%(95%CI:38.3% ～74. 8%)，非共享環(huán)境效應為38. 2% (95% CI:20.4% ～52.8%)。在CD8+T 細胞遺傳度模型擬合中，ACE 和AE 模型擬合成功，根據相關模型屬性RMSEA、AIC和△χ2的判定，選擇AE 模型為遺傳度擬合的最佳模型，獲得CD8+T 細胞亞群的遺傳度為57.3%(95%CI:34.5% ～70.2%)，非共享環(huán)境效應為42. 7% (95% CI:26. 2% ～61.9%)。

表3 CD4 +和CD8 + T 細胞亞群遺傳度模型選擇及計算Tab 3 Best-fitting univariate models choosing and heritability estimating for CD4 + and CD8 +T cell subsets

3 討論

在有效的卵型鑒定基礎上，本研究應用單因素結構方程模型［10］，對雙生子對間對內表型相似性及差異的比較，定量估計剛滿1 周歲幼兒外周血CD4+、CD8+T 細胞的遺傳和環(huán)境效應大小。已有多項研究表明，CD4+和CD8+T細胞數值未見顯著性別差異［3，11，12］，故本研究在計算遺傳度的過程中未將性別與年齡作為隱變量進行處理，單純選擇了單因素連續(xù)變量且僅包含雙生子樣本的結構方差模型進行分析。在選擇ADE 與ACE 模型之前，通過組內相關系數的分析，根據模型選擇原則［10］，發(fā)現CD4+和CD8+T細胞亞群的組內相關系數rDZ均＞1/2rMZ，未提示針對變量存在顯性遺傳作用(rDZ≤1/2rMZ)，因此最終選定ACE 模型實施擬合并將最后得到的嵌套模型(子模型)與全模型進行逐一比較，之后根據模型選擇原則確定AE 為最佳的模型。

本研究結果顯示，CD4+和CD8+T 細胞遺傳度分別為61.8%和57.3%，兩種細胞的遺傳度均稍高于Hall 等［5，6］的研究結果(CD4+T 細胞遺傳度56%，95% CI:41% ～68%;CD8+T 細胞遺傳度57%，95%CI:43% ～67%)?？赡芘c以下因素有關:①本研究選擇1 周歲健康幼兒雙生子作為研究對象，獲得的是同一年齡的研究對象表型，較年齡表型不一的人群更出色;②1 歲幼兒處于人體生長發(fā)育早期，其周圍所暴露的環(huán)境因素數量有限，且作用時間較短，環(huán)境因素影響表型的作用相對較小，與成年人群相比，該表型能更真實的體現遺傳效應大小。

模型擬合中依據最佳模型判定標準，在允許剔除共享環(huán)境因素之后，非共享環(huán)境效應分別占38.2%與42.7%。與遺傳度相反的是，幼兒影響CD4+和CD8+T 細胞數值的非共享環(huán)境效應要小于成人。已有研究提示不同年齡的成人外周血CD4+和CD8+T 細胞數量存在顯著差異，從新生兒期到成年過程中CD4+T 細胞的表達可能是一個正常生理性逐漸增加的過程［16］。有研究檢測58 份胎兒臍血中CD4+和CD8+T 細胞數值低于成人水平［17］。提示年齡是影響CD4+和CD8+T 細胞表達的因素之一。本研究統(tǒng)一選取1 周歲幼兒作為研究對象，排除了年齡對CD4+和CD8+T 細胞亞群數值的影響，獲得的1 周歲表型遺傳度更加接近于真實值。

本研究觀察到影響CD4+和CD8+T 細胞表達的不僅只有年齡因素。與相關環(huán)境因素的相關性分析顯示，MZ組孕婦孕齡和CD8+T 細胞相對計數呈弱負相關;DZ 組孕齡與CD4+T 細胞相對計數呈弱正相關。本研究結果與國外一項有關影響早產兒CD4+和CD8+T 細胞表達的環(huán)境因素研究［18］結果相吻合，該研究顯示早產兒CD8+、CD4+/CD8+T 細胞比值與孕齡、出生體重呈正相關，孕齡＜32 周組中的CD8+T 細胞數量較孕齡≥32 周組減少，提示孕齡未達足月可能會引起免疫功能下降;該研究還提示體重增長較低的早產兒CD4+T 細胞數量較低。本研究顯示，1 歲體重增加與CD4+T 細胞相對計數存在弱正相關，與文獻［18］研究結果相符。晚近研究顯示，出生時存在窒息缺氧史的兒童體內可出現T 細胞亞群紊亂，導致CD4+T 細胞減少［19］。本研究觀察到Apgar 評分與CD4+T 細胞相對計數呈弱正相關，驗證了上述文獻的結論，但其具體影響機制仍尚待研究。

本研究結果中有意義的提示有3 點，①根據模型信息反饋，遺傳因素作用要比環(huán)境因素對幼兒外周血CD4+和CD8+T 細胞亞群相對計數的影響更大;②再次證實了遺傳因素和環(huán)境因素共同影響幼兒外周血CD4+和CD8+T 細胞亞群相對計數;③幼兒CD4+和CD8+T 細胞遺傳度要高于成年人群。本研究的局限性:①機體免疫功能水平可通過較多指標進行反映，研究只選取了CD4+和CD8+T 細胞相對計數作為表型，未涉及檢測其他具有重要臨床意義的免疫功能水平指標;②研究中未對淋巴細胞絕對計數進行檢測，無法確定其他潛在因素對CD4+和CD8+T 細胞的影響，如幼兒體內潛在的細菌或病毒感染;③對于探索導致幼兒體內淋巴細胞亞群變化的遺傳-環(huán)境因素的研究，以外周血中CD4+和CD8+T 細胞相對還是絕對計數水平作為指標還有待明確;④本研究僅分析了孕婦圍生期及幼兒生命早期生長發(fā)育的相關環(huán)境因素，在后續(xù)研究中可建議對其他因素進行整合作進一步系統(tǒng)性研究來深化研究結論。

致謝 感謝新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院、烏魯木齊市婦幼保健醫(yī)院、新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院、中國人民解放軍烏魯木齊總醫(yī)院和烏魯木齊市第一人民醫(yī)院兒童保健科對本研究歷時2 年的現場工作給予的大力支持，以及新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗中心向本研究提供的實驗技術平臺;感謝余莉華醫(yī)生、張雪實驗師等人在本項目實驗室指標檢測環(huán)節(jié)給予的積極配合;對在《新生兒乙肝疫苗接種后弱無應答的雙生子研究》課題進行過程中付出過辛勤勞動的全體研究人員致以敬意。

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