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    CO/HO-2 體系在胎兔動脈導(dǎo)管組織中的表達

    2012-12-23 03:50:36向招燕李濤余明華李亞
    關(guān)鍵詞:內(nèi)參內(nèi)源性定量

    向招燕,李濤,余明華,李亞

    動脈導(dǎo)管未閉( patent ductus arteriosus,PDA) 是常見的先天性心臟病之一,大約占先天性心臟病的7% ~10%[1]。在足月兒中,其發(fā)病率為1/2000,男女比例為1:2[2]; 早產(chǎn)兒動脈導(dǎo)管未閉的發(fā)生率較足月兒高,可達20%左右[3];且胎齡和體重越小,發(fā)病率越高[4]。PDA 若未及時治療,??烧T發(fā)和促進慢性肺疾病、顱內(nèi)出血、心力衰竭等疾病,是影響早產(chǎn)兒致殘率和死亡率的重要因素之一。但到目前為止,動脈導(dǎo)管未閉的機制尚不十分明確。有研究顯示其與遺傳、缺氧、離子通道( 氧敏感性鉀通道) 、血管活性物質(zhì)( 前列腺素、內(nèi)皮素、血栓素) 等因素有關(guān)[5-7]。近年來,我們課題組研究表明氣體網(wǎng)絡(luò)分子系統(tǒng)[一氧化氮( NO) 、一氧化碳( CO) 、硫化氫( H2S) ]中的NO 和H2S 存在于動脈導(dǎo)管組織中,并且在PDA 的發(fā)病機制中起到一定的作用[8];亦有研究表明CO 在心血管系統(tǒng)中的功能與NO 相似,可以舒張血管,降低血管對收縮介質(zhì)的反應(yīng)。NO 在動脈導(dǎo)管的舒張與收縮中發(fā)揮著作用,所以我們推測如果動脈導(dǎo)管中存在CO 的表達,那么可能CO 也在動脈導(dǎo)管的舒張與收縮中發(fā)揮著與NO 相似的功能。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 胎齡30 d 的日本大耳白兔孕兔( 由湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心提供) ,體重2.5 ~5 kg,實驗動物許可證號:SYXK( 鄂)2011-0031。

    1. 2 主要試劑 Trizol 試劑( Life Technologies,美國) ;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒( Fermentas,美國) ;2* Taq PCR MasterMix( 天根生化科技,北京) ; 熒光定量PCR 試劑盒( Fermentas,美國) ;DL 1000 DNA Marker( TaKa-Ra,大連) ;實時熒光定量PCR 引物序列:HO-2 引物序列上游引物: 5'-AGC AGC ATA GTA GGG GCA TTT-3'下游引物:5'-ACC TGA ACC TGA AGA CCA AAG A-3',GAPDH 引物序列上游引物:5'-GGT GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3' 下游引物: 5'-GGT GCT GTA GCC AAA TTC GTT GT-3',引物均由上海生工生物工程;RIPA 裂解液( 強) ( Beyotime,上海) ;BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒( 天根生化科技,北京) ; 一抗兔抗兔HO-2( abcam,美國) ; 內(nèi)參小鼠抗兔B-actin( Beyotime,上海) ;二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔( 鼎國,北京) ;Prestained Protein ladder( Fermentas,美國) ;內(nèi)源性一氧化碳試劑盒( 南京建成) ; 其余試劑為國產(chǎn)市售分析純試劑。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 實驗分組 4 只孕齡為30 d 的的日本大耳白兔,共產(chǎn)下24 只足月的仔兔( 平均每只產(chǎn)仔6 只) ,產(chǎn)下的仔兔立即固定于工作臺上,在無菌的條件下,分別取出仔兔動脈導(dǎo)管組織(-80℃保存) 和新鮮心臟血,做好標(biāo)記,備用。

    1.3.2 仔兔動脈導(dǎo)管組織中HO-2 mRNA 表達水平的檢測 TRIzol 法抽提動脈導(dǎo)管中HO-2 mRNA,BioPhotometer plus 核酸蛋白測定儀檢測所提mRNA的濃度及純度( 總RNA OD260/OD280 均介于1.7 ~2.0 之間說明提取的總RNA 質(zhì)量純,這也保證后面熒光定量PCR 實驗的可靠性及可重復(fù)性) ,兩步法逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后進行RT-PCR 和實時熒光定量PCR 法檢測。所用引物均由上海生物工程有限公司合成。RT-PCR 反應(yīng)體系( 25μl 體系) : 按天根生化科技提供的步驟程序進行操作,并設(shè)內(nèi)參對照( 內(nèi)參引物為GADPH) 。擴增條件: 按天根生化科技提供的步驟程序進行操作,退火溫度58℃,其他條件不變。在Biometra Tpersonal 型擴增儀上擴增,Touching 凝膠系統(tǒng)上分析結(jié)果。SYBR 熒光定量PCR 反應(yīng)體系(25μl 體系) :qPCR Master Mix(2X)12.5μL,Water nuclease-free10.5μL,cDNA1μL,上游引物0.5 μL,下游引物0. 5μL,并設(shè)內(nèi)參對照( 內(nèi)參引物為GADPH) 。擴增條件:按Fermentas 公司提供的程序進行操作,退火溫度58℃,其他條件不變。在ABI Prism 7500 型熒光定量PCR 儀上進行擴增并分析實驗結(jié)果。

    1.3.3 仔兔動脈導(dǎo)管組織HO-2 蛋白表達水平的檢測 提取蛋白,BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度,計算蛋白上樣量,SDS-PAGE 電泳分離( 濃縮膠恒壓100 V,1 h;分離膠恒壓120 V,3 h) 、轉(zhuǎn)膜( PVDF 膜,恒壓18 V,2 h) ,室溫封閉1 h,分別依次加入一抗兔抗兔HO-2抗體(1:1000) ,內(nèi)參小鼠抗兔β-actin 抗體(1:800) ,4℃緩慢搖動孵育過夜,振洗后加入二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔(1:5000) ;室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。振洗完,顯色后SYNGENE上分析結(jié)果。

    1.3.4 胎兔血漿一氧化碳含量測定 按照南京建成生物工程所有限公司提供的實驗步驟操作,最后帶入公式計算。計算公式為:

    Hb( g/L) =540nm 處吸光度值× 367. 7; Hb-CO% =〔0.822 ×△OD( A568-A581) +0.001〕×100%; 全血中CO 含量( μmol/L) = HbCO% × Hb( g/L) ×106 ×4/64456

    1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 15.0 統(tǒng)計軟件進行分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s) 表示,P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 仔兔動脈導(dǎo)管組織中HO-2 mRNA 和蛋白表達水平 如圖1 所示: 各條帶清晰,無二聚體,說明仔兔動脈導(dǎo)管組織中存在HO-2 mRNA 的表達。如圖2 所示:仔兔動脈導(dǎo)管組織中H0-2 蛋白的表達呈陽性,從蛋白水平再次證實動脈導(dǎo)管中存在HO-2 蛋白的表達。

    圖1 動脈導(dǎo)管組織中HO-mRNA 凝膠電泳圖( 各條帶清晰可見,無二聚體,說明引物設(shè)計良好,1-4 條帶是HO-2 的表達,大小為182bp;5-8 條帶是內(nèi)參GAPDH,大小為112bp,M 條帶為DNA Marker)

    圖2 HO-2 的western blot 圖譜( 上面的條帶是內(nèi)參β-action,大小是42kD;下面的條帶為HO-2 蛋白的圖譜,大小是36kD)

    2.2 仔兔動脈導(dǎo)管組織中HO-2 mRNA 表達水平的實時熒光定量PCR 的結(jié)果 最終基因表達量用2-ΔΔCt 值表示,其中ΔΔCt =( HO-2mRNA Ct-GAPDH Ct) 實驗組-( HO-2mRNA Ct-GAPDH Ct) 空白組,其表達量為0.33 ±0.11。

    2.3 胎兔血漿一氧化碳含量測定結(jié)果 胎兔心臟全血中內(nèi)源性CO 的含量為53.09 ±6.73( μmol/L) 。

    3 討論

    CO 既往被認(rèn)為是有毒的氣體,但近年來,大量研究證實CO 與NO 相類似,即可以舒張血管,降低血管對收縮介質(zhì)的反應(yīng)。目前為止,發(fā)現(xiàn)體內(nèi)CO的來源中有兩條途徑,一條途徑是吸入的氣體中含有少量CO( 外源性CO) ;另一條途徑是體內(nèi)生成的CO( 內(nèi)源性CO) 。內(nèi)源性CO 的產(chǎn)生至少有2 個途徑,大部分是在血紅素的代謝過程中產(chǎn)生的,即HO催化血紅素生成膽綠素、CO、Fe3+; 少量是通過微粒體脂質(zhì)的過氧化產(chǎn)生,但對其作用機制尚不清楚。研究表明CO 對大鼠主動脈、肺動脈、尾動脈、冠狀動脈以及犬的股動脈、頸動脈、冠狀動脈等都可以直接調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞的舒縮狀態(tài)。Johnson 等[9]通過測定脈管擴張流量和脈壓發(fā)現(xiàn)CO 減弱脈管系統(tǒng)的擴張流量。HO 為內(nèi)源性CO 產(chǎn)生的限速酶,目前為止已經(jīng)證明HO 具有三種形式的同工酶:HO-1,HO-2,HO-3。HO-1 不僅對金屬,而且對引起氧化應(yīng)激和其它病理條件的所有刺激和化合物都十分敏感,Polizio 等[10]在果糖誘導(dǎo)的高血壓大鼠模型中發(fā)現(xiàn)HO-1 在器官抗氧化防御酶系統(tǒng)活性完好的情況下能發(fā)揮降低血壓作用。Zhu 等[11]通過試驗研究發(fā)現(xiàn),CBS/H2S 和HO-1/CO 系統(tǒng)在心肌缺血再灌注中起協(xié)同保護作用。Ito 等[12]在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)HO-1 可增加IL-10 的產(chǎn)生而降低肺動脈高壓。Vera 等[13]發(fā)現(xiàn)HO-1 降低血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓,并且減少超氧化物的產(chǎn)生。Coceani 等[14]采用免疫組織化學(xué)的方法對羊羔的動脈導(dǎo)管進行研究,發(fā)現(xiàn)血紅素加氧酶-1 在內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞上都有表達,而血紅素加氧酶-2 只在平滑肌細胞表達。近年研究顯示,肺血管平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞均有HO 蛋白及其活性的表達,是內(nèi)源性CO 生成和釋放的重要場所之一。

    動脈導(dǎo)管是一種特殊的血管,在出生后隨著肺呼吸、循環(huán)的建立,血氧張力提高,機體內(nèi)前列腺素迅速降解、緩激肽釋放等各種因素作用,促使動脈導(dǎo)管關(guān)閉,而在這些因素中前列腺素E2( PGE2) 對維持動脈開放的作用最為重要[15]。Chang 等[16]對小鼠研究表明出生后前列腺素E2對動脈導(dǎo)管的關(guān)閉與否起著關(guān)鍵作用。我們課題組發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性H2S( 內(nèi)源性氣體分子網(wǎng)絡(luò)中的一種) 不僅在大血管中能生成,而且在未出生的動物的動脈導(dǎo)管組織中也能產(chǎn)生,在動脈導(dǎo)管組織中有胱硫醚-γ-裂解酶基因表達。大量研究表明CO 在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用,與NO 類似,CO 也可以激活,升高胞漿中cGMP 水平,進而舒張血管。本研究證實了動脈導(dǎo)管中存在CO/HO-2,這為動脈導(dǎo)管的舒張與收縮機制的研究擴寬了領(lǐng)域。如果進一步的研究能證明CO在動脈導(dǎo)管的開放與關(guān)閉機制中發(fā)揮著作用,那么CO 是通過什么途徑舒張動脈導(dǎo)管的,這些內(nèi)容還有待進一步的研究。

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