石榴皮多酚提取物及純化物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究

張海均，賈冬英，孫 慧，姚 開(kāi)

四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，成都610065

α-葡萄糖苷酶是小腸絨毛上皮細(xì)胞刷狀緣膜上存在的寡糖水解酶，可催化α-1，4糖苷鍵水解，因此抑制α-葡萄糖苷酶的活性就能減緩葡萄糖的生成及吸收，降低餐后血糖峰值，減少高血糖對(duì)胰腺的刺激，提高胰島素敏感性，從而預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥［1］。α-葡萄糖苷酶抑制劑是一類(lèi)口服降血糖藥物，它能夠與小腸中α-葡萄糖苷酶的活性部位結(jié)合，抑制酶的催化作用，阻止可消化低聚糖水解為單糖，使單糖的吸收時(shí)間延后，抑制餐后血糖水平的快速升高。

大量研究顯示，一些多酚類(lèi)、黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)、生物堿類(lèi)等天然產(chǎn)物均能抑制α-葡萄糖苷酶的活性［2-5］。有關(guān)多酚類(lèi)抑制該酶活性的研究主要集中在茶多酚上，而有關(guān)石榴皮多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用卻鮮見(jiàn)報(bào)道。在本論文中作者研究了石榴皮多酚提取物及純化物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用及其抑制類(lèi)型，期望為石榴皮多酚的精細(xì)化利用提供重要參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

石榴皮粉由新鮮石榴皮曬干后粉碎、過(guò)20目篩而成;茶多酚，(80%，w/w)為四川省筠連縣茶多酚廠的產(chǎn)品。α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)和pNPG (4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;石油醚、丙酮、乙酸乙酯、沒(méi)食子酸、K2HPO4、KH2PO4、Na2CO3等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

UV2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司;DZF6030A真空干燥箱，上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 石榴皮多酚提取物與純化物的制備

稱(chēng)取一定量的石榴皮粉，加入其質(zhì)量3～5倍體積的石油醚脫脂，烘干后，用其質(zhì)量8～10倍的70%(v/v)丙酮溶液振蕩提取3次，每次1 h，合并濾液于40℃下真空濃縮，60℃下真空干燥，得到石榴皮多酚提取物。取一定體積的濃度為75 mg/mL石榴皮多酚提取物溶液，加入等體積的乙酸乙酯，充分振蕩后室溫靜置30 min，萃取2次，收集萃取相，將其進(jìn)行真空濃縮干燥后得到石榴皮多酚的初步純化物P-1。將處理好的D141大孔樹(shù)脂按常規(guī)濕法裝入玻璃柱(Ф 30 mm ×650 mm)，待樹(shù)脂完全沉降后用蒸餾水洗至平衡。取濃度為100 mg/mL的P-1溶液10 mL，緩慢上樣，先用300 mL蒸餾水洗脫，再用乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫(10% ～100%，v/ v)，洗脫速度為10 mL/min，等份收集洗脫液(50 mL/份)。將收集液真空濃縮至5 mL后用硅膠板G進(jìn)行TLC檢測(cè)，合并斑點(diǎn)相同的洗脫級(jí)份，將其進(jìn)行真空濃縮干燥后得到純化物P-2。

1.2.2 石榴皮多酚提取物與純化物的總酚含量測(cè)定

以沒(méi)食子酸(GA)為對(duì)照品，參考R.P.Singh等采用的Folin-酚法［6］對(duì)石榴皮多酚提取物及純化物中的總酚含量進(jìn)行測(cè)定，以GA當(dāng)量表示樣品的總酚含量。GA標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=0.66321X+0.00404，R2=0.9996，其中X為GA質(zhì)量濃度(μg/mL)，Y為吸光值。

1.2.3 α-葡萄糖苷酶活力測(cè)定

參照沈忠明等［7］和 Angelika Sch?fer［8］等的方法并稍作改動(dòng)。以0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.9)為溶劑分別配制1.0 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液和1.0 mmol/L底物pNPG溶液。將1.0 U/mL α-葡萄糖苷酶600 μL與蒸餾水600 μL混勻后于37℃水浴中保持10 min，然后加入1.0 mmol/L pNPG 200 μL啟動(dòng)反應(yīng)，混勻后于37℃下反應(yīng)30 min，再加入0.5 mol/L Na2CO31.0 mL終止反應(yīng)，混勻后稀釋反應(yīng)液，在400 nm處測(cè)定在酶的作用下底物釋放出的硝基酚量。α-葡萄糖苷酶活力單位定義為:pH 6.9、 37℃條件下每分鐘釋放1.0 μmol硝基酚為1個(gè)活力單位。

1.2.4 石榴皮多酚提取物及純化物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的測(cè)定

參照Angelika［8］的方法并稍作改動(dòng)。取1.0 U/ mL α-葡萄糖苷酶600 μL和不同濃度的待測(cè)樣品200 μL，按1.2.3中方法測(cè)定多酚樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用?？瞻讓?duì)照為蒸餾水，陽(yáng)性對(duì)照為茶多酚。平行測(cè)定3次，取平均值。按下式計(jì)算多酚樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率:

式中A1和A2分別為空白對(duì)照和多酚樣品溶液的吸光值。

以樣品濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制抑制曲線，由該曲線計(jì)算各多酚樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.5 石榴皮多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制類(lèi)型的測(cè)定

選取抑制作用較強(qiáng)的石榴皮多酚純化物，測(cè)定其抑制α-葡萄糖苷酶活性的類(lèi)型。酶反應(yīng)總體積1.0 mL，包括1.0 U/mg酶液600 μL、0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.9)200 μL以及不同濃度的石榴皮多酚純化物200 μL。然后分別加入1.0 mmol/L pNPG 0.2、0.1、0.067、0.05、0.04 mL，混勻后于37℃保持30 min，加入0.5 mol/L Na2CO31.0 mL。以底物濃度的倒數(shù)1/［S］為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速度的倒數(shù)1/V為縱坐標(biāo)作圖，繪制石榴皮多酚純化物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的雙倒數(shù)圖，然后根據(jù)雙倒數(shù)方程計(jì)算其抑制常數(shù)Ki。

2 結(jié)果與討論

2.1 石榴皮多酚提取物及純化物的總酚含量

經(jīng)測(cè)定，石榴皮多酚提取物以及純化物P-1和P-2中的多酚含量分別為總酚含量27.28、46.34和74.09 g/100 g。經(jīng)純化后樣品的總酚含量均有明顯提高。

2.2 石榴皮多酚提取物及純化物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

不同濃度的石榴皮多酚提取物和純化物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用見(jiàn)圖1和圖2?？梢钥闯?，石榴皮多酚提取物和純化物對(duì)α-葡萄糖苷酶均有較強(qiáng)的抑制作用，隨著濃度的增加，它們對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用均逐漸增強(qiáng)，尤其是純化物P-2對(duì)該酶的抑制作用與其濃度之間呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

表1是將圖1和圖2中數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸后得到的石榴皮多酚提取物和純化物對(duì)α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度(IC50)。IC50可表征多酚樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用強(qiáng)弱，IC50越小，說(shuō)明抑制作用越強(qiáng)。結(jié)合圖1和表1，可知3種多酚樣品中，純化物P-2對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性最大，純化物P-1次之，石榴皮多酚提取物的抑制作用最小。3種多酚樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用大小與其總酚含量一致，說(shuō)明樣品中含有的酚類(lèi)物質(zhì)是其產(chǎn)生抑制作用的主要成分。因此，純化有利于提高石榴皮多酚樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。此外，兩種石榴皮多酚純化物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用均高于茶多酚，但石榴皮多酚提取物對(duì)該酶的抑制作用低于茶多酚。

尹學(xué)哲等［9］研究表明，綠茶提取物抑制α-葡萄糖苷酶的IC50為0.13 mg/mL;林玉桓等［10］研究了34種中藥水提物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，結(jié)果顯示虎杖水提物抑制該酶的IC50為27.5 mg/mL。石榴皮多酚純化物P-2抑制α-葡萄糖苷酶的IC50明顯低于上述多酚樣品和茶多酚，說(shuō)明該純化物對(duì)α-葡萄糖苷酶具有很強(qiáng)的抑制作用。

表1 石榴皮多酚樣品對(duì) α-葡萄糖苷酶半數(shù)抑制濃度(IC50)Table 1 IC50values of pomegranate peel polyphenol extract and its purified fractions on α-glucosidase

2.3 石榴皮多酚純化物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用類(lèi)型

以抑酶活性最強(qiáng)的石榴皮多酚純化物P-2為抑制劑，測(cè)定了其在濃度分別為0.01 mg/mL和0.02 mg/mL時(shí)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用類(lèi)型。以底物濃度的倒數(shù)1/［S］為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速度的倒數(shù)1/ V為縱坐標(biāo)，繪制石榴皮多酚純化物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制的雙倒數(shù)圖(見(jiàn)圖3)?？梢钥闯觯S著石榴皮多酚純化物濃度的增大，其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用逐漸增強(qiáng)，因此它對(duì)該酶的抑制作用為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。當(dāng)濃度為0.01 mg/mL時(shí)，該純化物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制常數(shù)Ki為1.22 μg/mL。

圖3 石榴皮多酚純化物抑制α-葡萄糖苷酶的作用類(lèi)型Fig.3 Inhibition type of purified polyphenols from pomegranate peel extract on α-glucosidase

林玉桓等［10］和劉杰超等［11］研究顯示，虎杖水提物和蘋(píng)果多酚提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制?？滴乃嚨龋?2］發(fā)現(xiàn)牛耳巖白菜正丁醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用為競(jìng)爭(zhēng)性抑制類(lèi)型。尚禹東等［13］研究顯示，銀杏葉醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶有明顯的抑制效果，其作用機(jī)制為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。這些結(jié)果表明，酚類(lèi)提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用類(lèi)型包括非競(jìng)爭(zhēng)性抑制、競(jìng)爭(zhēng)性抑制和反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。不同酚類(lèi)提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用類(lèi)型有所不同，這可能與其主要抑酶活性成分的組成與結(jié)構(gòu)以及與酶活性中心的結(jié)合部位和結(jié)合方式等的不同有關(guān)。

3 結(jié)論

石榴皮多酚提取物及純化物均能有效抑制α-葡萄糖苷酶的活性，該抑制作用與其濃度之間存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。隨著石榴皮提取物與純化物濃度的增大，它們對(duì)該酶的抑制作用增強(qiáng)。石榴皮多酚純化物較其提取物和茶多酚具有更強(qiáng)的抑制作用。石榴皮多酚純化物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用類(lèi)型為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。有關(guān)石榴皮多酚純化物中對(duì)α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生抑制作用主要單體組分的分離、純化、結(jié)構(gòu)表征及其作用機(jī)理仍有待于進(jìn)一步研究。

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