盤基網(wǎng)柄菌發(fā)育中尿囊酸酶表達(dá)的定量定位研究

代 卉， 侯連生

（華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062）

盤基網(wǎng)柄菌發(fā)育中尿囊酸酶表達(dá)的定量定位研究

代 卉， 侯連生

（華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062）

用免疫熒光技術(shù)對KAx-3多細(xì)胞發(fā)育不同階段的尿囊酸酶進(jìn)行定位觀察，用Western blot分析野生型細(xì)胞KAx-3和突變型細(xì)胞AK127多細(xì)胞發(fā)育中尿囊酸酶的表達(dá)情況.結(jié)果顯示：在細(xì)胞聚集階段，尿囊酸酶在盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞膜附近存在較多；在細(xì)胞丘階段，尿囊酸酶在細(xì)胞丘外層細(xì)胞中熒光強(qiáng)度較強(qiáng)；在蛞蝓體階段，尿囊酸酶在前柄細(xì)胞中的表達(dá)量明顯多于前孢子細(xì)胞；在子實體成熟的過程中，在前柄細(xì)胞區(qū)與前孢子細(xì)胞區(qū)交界處熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，該區(qū)域內(nèi)細(xì)胞將分化成前柄細(xì)胞B.據(jù)此推測尿囊酸酶的定位表達(dá)可能與盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞分化的類型相關(guān).Western blot結(jié)果顯示：在KAx-3發(fā)育過程中尿囊酸酶的表達(dá)量呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，發(fā)育至18 h左右達(dá)到最大值；而AK127中尿囊酸酶的表達(dá)量始終在低水平徘徊.這表明gp150的缺失影響了尿囊酸酶的表達(dá).實驗結(jié)果提示，尿囊酸酶的表達(dá)量與發(fā)育時間有關(guān)，并且這種表達(dá)量的變化與gp150存在著密切的關(guān)系.

尿囊酸酶； 定量分析； 定位觀察； gp150

0 引 言

野生型盤基網(wǎng)柄菌多細(xì)胞發(fā)育的不同階段形態(tài)各不相同，因此，將其大致地分為了4個發(fā)育階段：細(xì)胞聚集階段、細(xì)胞丘階段、蛞蝓體階段和由孢子細(xì)胞與柄細(xì)胞構(gòu)成的子實體階段［1］.盤基網(wǎng)柄菌的多細(xì)胞發(fā)育始于生存環(huán)境中食物的缺乏.饑餓的盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞會分泌cAMP誘導(dǎo)臨近細(xì)胞向其聚集形成細(xì)胞丘，然后在細(xì)胞分化因子的作用下開始初步分化，形成前柄細(xì)胞（prestalk cell，pst）和前孢子細(xì)胞（prespore cell，psp）.前柄細(xì)胞分化比較復(fù)雜，又進(jìn)一步分化成各種亞型：位于細(xì)胞丘頂端是前柄細(xì)胞A（prestalk A cell，pstA），表達(dá)前柄細(xì)胞特異基因ecmA；而前柄細(xì)胞B（prestalk B cell，pstB）則位于細(xì)胞丘底部，表達(dá)ecmB特異基因.蛞蝓體階段，細(xì)胞分化進(jìn)一步明顯：前端形成由前柄細(xì)胞A和前柄細(xì)胞O（prestalk O cell，pstO）組成的前柄細(xì)胞區(qū)；后端則大部分為psp細(xì)胞；底部仍有少量pstB細(xì)胞存在，被稱之為后衛(wèi)細(xì)胞；此外，在pstO細(xì)胞與psp細(xì)胞的交界處也存在pstB細(xì)胞.進(jìn)入拔頂階段后，可以在前柄細(xì)胞區(qū)檢測到新形成的前柄細(xì)胞AB（prestalk AB cell，pstAB），它同時表達(dá)ecmA和ecmB基因.在盤基網(wǎng)柄菌的整個發(fā)育過程中，pstO細(xì)胞可分化成pstA細(xì)胞，pstA細(xì)胞可分化成pstB細(xì)胞，并最終形成柄細(xì)胞；而psp細(xì)胞最終形成成熟的孢子［1，2］.因此與前柄細(xì)胞分化相關(guān)的因子引起了我們的研究興趣.有研究報道氨可以抑制盤基網(wǎng)柄菌在多細(xì)胞發(fā)育過程中細(xì)胞對cAMP的趨化作用［3］；氨通過抑制細(xì)胞分化因子的累積可抑制柄細(xì)胞的發(fā)育，并促進(jìn)孢子細(xì)胞的成熟；氨刺激前孢子細(xì)胞基因表達(dá)的同時抑制前柄細(xì)胞基因的表達(dá)［4，5］；嘌呤代謝途徑中產(chǎn)生的氨在機(jī)體缺乏氮源時可作為氮的來源［6］.本實驗室篩選到的相關(guān)基因尿囊酸酶（allanoicase，EC3.5.3.4）是生物體嘌呤代謝途徑中一種重要的酶，可水解尿囊酸為尿素和乙醛酸，在低等生物中還可進(jìn)一步分解成為氨和二氧化碳［7］，可見尿囊酸酶與氨的代謝有著密切關(guān)系.但是盤基網(wǎng)柄菌發(fā)育過程中尿囊酸酶的分布位置和表達(dá)情況未見報導(dǎo)，故本文對此進(jìn)行了研究，為深入探討尿囊酸酶對細(xì)胞發(fā)育過程的影響提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng)

盤基網(wǎng)柄菌KAx-3與AK127均為加拿大多倫多大學(xué)Dr.Siu實驗室提供，按Sussman法［8］將盤基網(wǎng)柄菌KAx-3和AK127培養(yǎng)于SM培養(yǎng)基上并喂食以克雷伯氏菌，收集生長對數(shù)期的細(xì)胞，并用磷酸緩沖液（pH6.4）將待發(fā)育的細(xì)胞洗凈.

1.2 細(xì)胞發(fā)育

1.2.1 蓋玻片上的細(xì)胞發(fā)育

用PDF緩沖液（MgCl20.5 g，硫酸鏈霉素0.5 g，KCl 1.5 g，K2HPO41.6 g，KH2PO41.6 g，加水至1 L，pH6.4）配制成2×106個／mL的細(xì)胞懸浮液，在預(yù)先涂有0.1%（w／v）多聚賴氨酸的蓋玻片上加500μL細(xì)胞懸浮液，靜置15 min，吸去400μL上清液.將蓋玻片放在濕盒中，置于24℃恒溫培養(yǎng)箱中開始發(fā)育.

1.2.2 瓊脂板上的細(xì)胞發(fā)育

用PDF緩沖液配制成2×108個／mL的細(xì)胞懸浮液，鋪500μL懸浮液在2%的瓊脂板上，放入24℃恒溫箱中進(jìn)行發(fā)育.每隔2 h收集發(fā)育細(xì)胞.細(xì)胞計數(shù)，按1×107個／管分裝于各eppendorf管中.

1.3 免疫熒光

將發(fā)育至不同階段的KAx-3細(xì)胞放入4℃冰箱預(yù)冷1 min，室溫下用3.7%甲醛溶液（pH6.4）固定細(xì)胞15 min，再用－20℃預(yù)冷的含1%甲醛的甲醇溶液固定5 min，1%BSA封阻20 min，然后用抗尿囊酸酶蛋白的抗體孵育1 h（1∶500），0.05%PBST緩沖液洗3次后，用FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG室溫孵育1 h（1∶100），再用0.02%PBST緩沖液洗3次，最后用封片液封片，置于熒光顯微鏡下觀察.

1.4 蛋白免疫印跡

每隔2 h收集KAx-3發(fā)育至不同階段的細(xì)胞，按Laemmli（1970）法進(jìn)行SDS-PAGE電泳［9］.每管加入100μL上樣緩沖液，沸水煮5 min，電泳后進(jìn)行 Western blot轉(zhuǎn)膜1.5 h，用5%脫脂奶粉封閉硝酸纖維薄膜，在1∶2 000比例稀釋的抗尿囊酸酶蛋白的抗體溶液和按1∶1 000比例稀釋的鼠源GAPDH溶液中孵育2 h，用堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG檢測已連接的抗體，并用堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG檢測內(nèi)參GAPDH.最后用NBT／BCIP顯色，拍照，結(jié)果用Quantity One（Bio-Rad公司）軟件分析.

每隔2 h收集AK127發(fā)育至不同階段的細(xì)胞，按上述步驟進(jìn)行蛋白免疫印跡實驗.

2 結(jié) 果

2.1 尿囊酸酶在盤基網(wǎng)柄菌KAx-3中的定位觀察

在細(xì)胞發(fā)育初期，主要發(fā)生細(xì)胞間相互接觸，然后粘連在一起的事件.這些細(xì)胞經(jīng)免疫染色后，在細(xì)胞與細(xì)胞接觸區(qū)域能見到明顯的尿囊酸酶強(qiáng)熒光，而在細(xì)胞內(nèi)部，熒光強(qiáng)度則比較均勻，表明此時尿囊酸酶主要集中在細(xì)胞膜附近區(qū)域（見圖1A箭頭所示）.發(fā)育至細(xì)胞丘階段，此時細(xì)胞分化尚不明顯，但細(xì)胞丘的最外層細(xì)胞中尿囊酸酶熒光最強(qiáng)，表明尿囊酸酶在最外層細(xì)胞中表達(dá)量最多（見圖1B和1C箭頭所示）.在蛞蝓體階段，細(xì)胞出現(xiàn)明顯分化.蛞蝓體主要分化成兩個區(qū)域，前端為前柄細(xì)胞區(qū)，后部為前孢子細(xì)胞區(qū).本文觀察到蛞蝓體前端的熒光明顯強(qiáng)于蛞蝓體后部，這意味著前柄細(xì)胞中尿囊酸酶的表達(dá)多于前孢子細(xì)胞（見圖1D箭頭所示）.在蛞蝓體發(fā)育至成熟子實體的過程中，從總體上看來，前柄細(xì)胞區(qū)內(nèi)尿囊酸酶的表達(dá)量高于前孢子細(xì)胞區(qū)內(nèi)尿囊酸酶的表達(dá)量.但是由于前柄細(xì)胞發(fā)生了亞型分化，尿囊酸酶熒光強(qiáng)弱也發(fā)生了變化.起初整個前柄細(xì)胞區(qū)熒光強(qiáng)度基本一致（見圖1E箭頭所示），但是隨著發(fā)育的進(jìn)行，熒光強(qiáng)度開始發(fā)生變化，在前柄細(xì)胞區(qū)與前孢子細(xì)胞區(qū)交界處，熒光開始變強(qiáng)（見圖1F中箭頭所示）.隨著發(fā)育時間的增加，前柄細(xì)胞和前孢子細(xì)胞趨于成熟，兩者交界處的熒光染色愈發(fā)顯得強(qiáng)烈（見圖1G箭頭所示）.

圖1 KAx-3多細(xì)胞發(fā)育不同階段中尿囊酸酶的熒光定位Fig.1 Localization of allanoicase in the different development stages of KAx-3

2.2 尿囊酸酶的定量表達(dá)

為了進(jìn)一步探究尿囊酸酶在盤基網(wǎng)柄菌發(fā)育中的作用，用蛋白免疫印跡法研究了盤基網(wǎng)柄菌發(fā)育各時間段尿囊酸酶的表達(dá)情況.

在盤基網(wǎng)柄菌KAx-3細(xì)胞整個發(fā)育階段，尿囊酸酶都有表達(dá)（見圖2），并且隨著發(fā)育進(jìn)程，呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，在18 h達(dá)到最多，18 h之后，其表達(dá)量驟然下降（見圖4）.AK127細(xì)胞是gp150蛋白的基因被剔除的盤基網(wǎng)柄菌突變細(xì)胞.在AK127整個多細(xì)胞發(fā)育期間，依然觀察到尿囊酸酶能夠表達(dá)（見圖3），但是除了發(fā)育8 h時尿囊酸酶的表達(dá)量有所增加外，其余時間段尿囊酸酶的表達(dá)量便不再呈現(xiàn)上升趨勢，而是在一個相對較低的范圍內(nèi)波動（見圖4）.

3 分析討論

3.1 關(guān)于尿囊酸酶在盤基網(wǎng)柄菌多細(xì)胞發(fā)育過程中的定位分析

圖2 盤基網(wǎng)柄菌KAx-3細(xì)胞發(fā)育不同時期尿囊酸酶免疫印跡Fig.2 Western blot analysis of allanoicase during different developmental stages of KAx-3

圖3 盤基網(wǎng)柄菌AK127細(xì)胞發(fā)育不同時期尿囊酸酶免疫印跡Fig.3 Western blot analysis of allanoicase during different developmental stages of AK127

圖4 KAx-3和AK127發(fā)育不同階段尿囊酸酶的表達(dá)變化Fig.4 Allanoicase quantitative changes of different developmental stages of KAx-3 and AK127

通過觀察發(fā)現(xiàn)，尿囊酸酶在盤基網(wǎng)柄菌多細(xì)胞發(fā)育中的定位具有時空性.聚集初期，細(xì)胞尚未進(jìn)行分化，尿囊酸酶在兩細(xì)胞接觸區(qū)域較多，說明其可能參與了細(xì)胞最初聚集過程的調(diào)控.細(xì)胞丘階段，尿囊酸酶則在細(xì)胞丘的外層細(xì)胞中大量表達(dá)，而這些外層細(xì)胞有著分化發(fā)育為柄細(xì)胞的潛質(zhì).隨著發(fā)育的進(jìn)行，細(xì)胞開始了初步分化，特別是蛞蝓體階段，在形態(tài)上能清楚地觀察到蛞蝓體分成前后兩個部分，前1／5為前柄細(xì)胞區(qū)，后4／5為前孢子細(xì)胞區(qū)，從實驗結(jié)果可以看到，尿囊酸酶在蛞蝓體前1／5處的熒光強(qiáng)于后4／5，表明尿囊酸酶在蛞蝓體前柄細(xì)胞中的表達(dá)量要多于前孢子細(xì)胞.在形成成熟子實體的過程中，總體上尿囊酸酶前柄細(xì)胞中的表達(dá)量多于前孢子細(xì)胞，但是隨著細(xì)胞進(jìn)一步分化，在前柄細(xì)胞的某一區(qū)域內(nèi)熒光逐漸增強(qiáng)，說明這個區(qū)域內(nèi)尿囊酸酶的表達(dá)量越來越高.國外學(xué)者研究認(rèn)為，在前柄細(xì)胞區(qū)與前孢子細(xì)胞區(qū)交界處的細(xì)胞將會分化成pstB細(xì)胞［1，2］.結(jié)合實驗結(jié)果，提示尿囊酸酶與pstB細(xì)胞的分化有著密切的關(guān)系.綜上所述，細(xì)胞開始分化發(fā)育后，在前柄細(xì)胞中尿囊酸酶的表達(dá)一直多于前孢子細(xì)胞，由于前柄細(xì)胞亞型分化開始，在前柄細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)弱出現(xiàn)變化，在pstB細(xì)胞中表達(dá)量逐漸增多.因此細(xì)胞發(fā)育的不同時期尿囊酸酶蛋白在不同類型細(xì)胞中的表達(dá)有差異，說明該蛋白定位表達(dá)與細(xì)胞類型分化有著密切的關(guān)系.

3.2 關(guān)于尿囊酸酶在兩種類型的細(xì)胞中表達(dá)量的初步分析

對尿囊酸酶在兩種類型盤基網(wǎng)柄菌發(fā)育中的表達(dá)情況進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，盡管尿囊酸酶在KAx-3多細(xì)胞發(fā)育過程中一直都有表達(dá)，但其呈現(xiàn)出與發(fā)育過程相關(guān)的變化趨勢.在發(fā)育前18 h，尿囊酸酶的表達(dá)量呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，至18 h表達(dá)量最多，隨后尿囊酸酶的表達(dá)量急劇下降，此時正處于子實體的形成階段.子實體是由纖維化的柄支持著大量的休眠孢子，分析認(rèn)為導(dǎo)致尿囊酸酶急劇下降的原因有二：一是細(xì)胞發(fā)育至子實體階段，柄細(xì)胞開始發(fā)生凋亡逐步成為死細(xì)胞，尿囊酸酶蛋白的表達(dá)量逐漸減少；二是前孢子細(xì)胞開始發(fā)育成成熟的孢子，孢子細(xì)胞是休眠細(xì)胞，新陳代謝處在很低的水平，所以隨著前孢子細(xì)胞分化的進(jìn)行，細(xì)胞的新陳代謝也逐漸減慢，結(jié)果導(dǎo)致了尿囊酸酶蛋白含量的下降.雖然在AK127多細(xì)胞發(fā)育過程中尿囊酸酶蛋白一直都有表達(dá)，但是發(fā)育8 h時后尿囊酸酶的表達(dá)量不升反降，并在一個相對較低的范圍內(nèi)波動.從實驗結(jié)果中可看到KAx-3細(xì)胞和AK127細(xì)胞中尿囊酸酶的表達(dá)趨勢有明顯差別.AK127是LagC基因被剔除的細(xì)胞，其發(fā)育只能停滯在細(xì)胞松散聚集階段，不能完成整個發(fā)育過程.LagC基因編碼膜蛋白gp150分子，而gp150是通過異噬性相互作用來調(diào)節(jié)盤基網(wǎng)柄菌多細(xì)胞的發(fā)育［11］.這也就意味著gp150的缺失影響了尿囊酸酶的表達(dá)，而且據(jù)報道gp150是在多細(xì)胞發(fā)育10 h后才開始表達(dá)的［12］.KAx-3細(xì)胞發(fā)育10 h后，尿囊酸酶的表達(dá)量明顯增加，這與gp150蛋白的表達(dá)時間存在一定的相關(guān)性.與此相反，AK127細(xì)胞除了在發(fā)育8 h時，作為一種補(bǔ)償效應(yīng)，尿囊酸酶的表達(dá)突然上升外，其他時間段都在一個較低的表達(dá)范圍內(nèi)波動，與KAx-3細(xì)胞中尿囊酸酶的表達(dá)有明顯差別.因此，尿囊酸酶的表達(dá)受到了gp150的影響，但是兩者間是直接地相互影響，還是間接地相互影響，尚不清楚，需要做進(jìn)一步的研究.

［1］ 付卓敏，侯連生.盤基網(wǎng)柄菌（Dictyostelium discoideum）細(xì)胞的分化及其調(diào)控［J］.細(xì)胞生物學(xué)雜志，2002，24（5）：289-293.

［2］ WEEKS G.Signaling molecules involved in cellular differentiation during Dictyosteliummorphogenesis［J］.Current Opinion in Microbiology，2000，3（6）：625-630.

［3］ MANN S K，F(xiàn)IRTEL R A.cAMP-dependent protein kinase differentially regulates prestalk and prespore differentiation during Dictyosteliumdevelopment［J］.Development，1993，119（1）：135-146.

［4］ NOUYE K.Induction by acid load of the maturation of prestalk cells in Dictyostelium discoideum［J］.Development，1988，104：669-676.

［5］ FEIT I N，PAWLIKOWSKI J，ZAWILSKI C.A model for cell type localization in the migrating slug of Dictyostelium discoideumbased on differential chemotactic sensitivity to cAMP and differential sensitivity to suppression of chemotaxis by ammonia［J］.Bioscience，2007，32（2）：329-338.

［6］ LEULLIOT N，QUEVILLON-CHERUEL S，SOREL I，et al.Crystal structure of Yeast allantoicase reveals a repeated jelly roll motif［J］.The Journal of Biological Chemistry，2004，279：23447-23452.

［7］ XU Z W，ZHOU H X，HUANG W N.Some properties of the allantotate amidohydrolase from French bean seedlings［J］.Acta Photophysiologica Sinica，2004，30（4）：460-468.

［8］ SUSSMAN M.Cultivation and synchronous morphogenesis of Dictyosteliumunder controlled experimental conditions［J］.Methods Cell Biology，1987，28：9-29.

［9］ LAEMMLI U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4［J］.Nature，1970，227：680-685.

［10］ EICHINGE L，PACHEBAT J A，GLOCKNER G，et al.The genome of the social amoeba Dictyostelium discoideum［J］.Nature，2005，435：43-57.

［11］ BROCK D A，BUCZYNSKI G，SPANN T P，et al.Dictyosteliummutant with defective aggregate size determination［J］.Development，1996，122：2569-2578.

［12］ WANG J，HOU L S，AWERY D.The membrane glycoprotein gp150is encoded by the LagC gene and mediates cell-cell adhesion by heterophilic binding during DictyosteliumDevelopment［J］.Developmental Biology，2002，227：734-745.

Quantitation and localization of allanoicase during the development of Dictysotelium discoideum

DAI Hui， HOU Lian-sheng

（School of Life Science，East China Normal University，Shanghai 200062，China）

Location and expression of allanoicase were observed in the wild type KAx-3 and mutant type AK127 cells during development by immunofluorescent technique and Western blot，respectively.The results showed that abundant of allanoicase existed near the cytomembrane at the aggregation stage.At the mound stage，the fluorescence of allanoicase in the peripheral cells of mound was stronger than other place cells.When they developed into slug stage，more allanoicase existed in prestalk cells than that in prespore cells.The fluorescence of allanoicase expressed strongly at the junction of prespore area and prestalk area at the fruiting body stage，these cells would differentiate into prestalk B cells.These data indicated that there may be somerelationships between the expression of allanoicase and cell-type differentiation during Dictysotelium discoideumdevelopment.The results of western blot showed that the expression of allanoicase increased gradually in the development of KAx-3 cells.The expression amount of allanoicase was maximum when the cells developed nearly18 h.But the expression of allanoicase in AK127 cells which gene of gp150 protein was knocked out was always at a low level.It shows that the expression of allanoicase would be affected in the absence of gp150.The results indicate that the expression of allanoicase has some relationships with the developmental time of the cells，and is also associated with the expression of gp150 gene.

allanoicase； quantitative analysis； orientation observation； gp150

Q959.11

A

10.3969／j.issn.1000-5641.2012.04.008

1000-5641（2012）04-0061-06

2011-05

國家自然科學(xué)基金（30970316，30670266）

代卉，女，碩士研究生.

候連生，男，教授，研究方向為細(xì)胞粘附分子和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo).E-mail：lshou＠bio.ecnu.edu.cn.