丹參對大鼠肝缺血再灌注損傷PI3K-AKT信號傳導通路的影響

李 程 畢旭東 趙國偉 (遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧 錦州 121001)

肝臟是易受缺血再灌注損傷的器官，其缺血再灌注損傷〔1〕是肝臟外科常見的問題。通過傳統(tǒng)醫(yī)學手段防治缺血再灌注，保護肝功能是臨床醫(yī)師的一條可選之路。大量研究證實，活血化瘀中藥，對肝臟缺血再灌注損傷(HIRI)具有保護作用〔2，3〕，而丹參正是此類藥物，其有關作用機制的研究很多，其中PI3KAkt信號傳導通路〔4，5〕受到較多關注，本實驗選擇研究丹參注射液對大鼠肝缺血再灌注后PI3K-Akt信號傳導通路的影響，以期明確其對HIRI的保護機制，為臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD大鼠80只，體重250～300 g，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2 藥物及試劑 丹參注射液(四川三精升和制藥有限公司，批號：Z51021303);PI3K、Akt抗體(北京博奧森生物技術有限公司);Phospho-Akt(Thr308)抗體、PI3K抑制劑(LY294002)(碧云天生物技術研究所);細胞凋亡試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及動物模型制作 隨機分為四組，即假手術組、IR組、SI組和 LY組，各組再按再灌注時間1、3、6、24 h分為4個時相，每組每時相為5只。實驗前12 h禁食，自由飲水，術前10%水合氯醛3.0 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉。IR組：仰臥位，腹部正中切口，按Yoshidome法，分離出肝十二指腸韌帶，用無損傷動脈夾鉗閉肝中葉和左側葉的動脈、門靜脈和膽管，造成70%肝缺血模型，切口覆蓋溫濕紗布，60 min后松開動脈夾恢復血供，每只大鼠分別于缺血前30 min經(jīng)尾靜脈緩慢注射生理鹽水2.0 ml;假手術組：單純麻醉和開腹，分離出肝十二指腸韌帶，僅暴露肝中葉和左側葉動脈、門靜脈和膽管，不進行阻斷，余同IR組;SI組：按2 ml/kg，用生理鹽水稀釋至2.0 ml，于阻斷血供前30 min經(jīng)尾靜脈注入，余同 IR組;LY組：按 LY 1.5 mg/kg，丹參2 ml/kg，分別用生理鹽水稀釋，要求兩者稀釋后總量為2 ml，且LY和SI分別于阻斷前1 h和30 min經(jīng)尾靜脈注入，余同IR組。

1.3.2 標本收集 各組分別在再灌注1、3、6、24 h對五只大鼠采取心腔針刺采血約5 ml，室溫靜置約1 h后于3 000 r/min離心10 min，取血清待測;取左肝葉組織，置于4℃生理鹽水中充分洗去血液后以濾紙拭干，置于液氮中，于-80℃冰箱保存待測;再取左葉肝組織，置于10%甲醛溶液中固定。

1.3.3 ALT、AST、LDH的測定 用全自動化生化分析儀檢測。

1.3.4 病理切片制作及HIRI病理診斷標準 取10%甲醛溶液中固定48 h后的肝組織，逐級乙醇脫水，二甲苯浸泡，浸蠟、石蠟包埋、切片、附貼，HE染色。HIRI病理損傷的嚴重程度用Suzuki標準〔4，5〕評定，由2位有經(jīng)驗的病理學醫(yī)生采用雙盲法對每個標本進行評分。

1.3.5 TUNEL法檢測肝細胞凋亡 操作TUNEL試劑盒按說明書進行。用不含末端脫氧核酸轉移酶的反應磷酸鹽緩沖液(PBS)作陰性對照，用DNA酶Ⅰ處理的組織切片作陽性對照。光學顯微鏡下觀察細胞核呈棕黃色著色者為凋亡細胞。每例切片隨機計數(shù)10個400倍視野，平均每100個細胞中凋亡細胞數(shù)為細胞凋亡指數(shù)(AI)。

1.3.6 PI3K、Akt、p-Akt酶的測定 取已準備存放于-80℃的肝組織，稱取0.1 g，冰浴，加入500 μl組織裂解液，冰浴勻漿，4℃，12 000 r/min離心10 min收集上清，應用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。其余樣品用4×loading buffer稀釋，封閉后100℃水浴10 min，-80℃保存。以每個樣品的總蛋白為20 g上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜至PVDF，脫脂奶粉封閉，一抗封閉4℃過夜，二抗37℃孵育1 h(羊抗兔)，漂洗后用增強化學發(fā)光法檢測蛋白表達，自動掃描，應用進行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS15.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)以s表示。組間差異應用單因素方差分析及LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 血清ALT、AST、LDH水平 IR、SI、LY組肝缺血再灌注后各時相的ALT、AST、LDH值明顯高于假手術組(P＜0.05);SI組、LY組各個時相的值較IR組均下降(P＜0.05);與LY組比較，SI組各個時相的值均明顯下降(P＜0.05);其中，ALT、AST、LDH值在缺血再灌注后均升高，IR、SI和LY組組內(nèi)各時相各值均在再灌注后6 h最高(P＜0.05)。見表1～表3。

表1 各組血清AST濃度變化(s，U/L，n=5)

表1 各組血清AST濃度變化(s，U/L，n=5)

與I/R組比較：1)P＜0.05;與SI組比較：2)P＜0.05，下表同

1 h 3 h 6 h 24 h組別

2.2 肝細胞的病理形態(tài)學變化 取6 h肝組織切片，HE染色，光鏡下觀察。假手術組肝細胞及肝竇內(nèi)皮細胞正常，肝竇及肝索排列規(guī)則;IR組肝組織中大量炎性細胞聚集、浸潤，以中央靜脈為甚，肝竇變窄，肝索排列紊亂，可見肝細胞水腫及空泡樣變性，偶見點狀壞死;LY組較IR組肝淤血程度輕，肝索及肝竇排列較規(guī)則，炎性細胞浸潤較輕;SI組的肝小葉及肝血竇淤血程度輕，肝小葉結構基本正常，細胞變性不明顯，少有炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組肝細胞病理HE染色結果(×400)

表2 各組血清ALT濃度變化(s，U/L，n=20)

表2 各組血清ALT濃度變化(s，U/L，n=20)

1 h 3 h 6 h 24 h假手術組 68.10±5.90 68.73±4.73 65.33±3.95 63.81±4.33組別IR 203.08±12.13 599.62±15.24 869.16±26.12 233.19±7.38 SI 142.97±9.671) 312.22±9.701) 514.33±16.501)130.92±6.811)LY 171.84±3.612)398.34±11.322) 714.02±20.272)159.88±7.042)

表3 各組LDH濃度變化( s，U/L，n=20)

表3 各組LDH濃度變化( s，U/L，n=20)

1 h 3 h 6 h 24 h假手術組 424.50±16.79 435.36±13.04 456.82±19.69 454組別.20±24.64 IR 1143.65±66.48 3 179.10±124.21 4 785.39±150.26 853.76±29.21 SI 889.35±54.991) 1 331.85±28.481)1 800.34±105.091)581.54±23.721)LY 1 003.43±52.592)2 004.89±111.472)1 799.76±86.172) 582.32±21.562)

圖2 各組凋亡檢測結果(×400)

2.3 各組AI比較 圖2所示，與假手術組比較，IR、SI、LY組各時相肝細胞AI值均增加(0.91±0.19，36.05±4.22，14.5±1.74，24.71±3.21，P ＜0.05);與 IR 組比較，SI組及 LY 組各時相AI值均減少(P＜0.05);與LY組比較，SI組各時相AI值均減少(P＜0.05);其中IR、SI、LY組組內(nèi)各時相以再灌注6 h時AI值最高。

2.4 檢測PI3K、Akt、p-Akt 各組PI3K、AKT的表達無顯著差異(P＞0.05);而在p-Akt的表達中，假手術、IR、LY組組間無顯著差異(P＞0.05)，SI組的表達各時相都高于假手術、IR、LY組，且均有顯著差異(P＜0.05)。見圖3。

圖3 各組p-AKT表達

3 討論

肝切除過程中常需要阻斷肝門而不可避免地產(chǎn)生肝臟缺血再灌注損傷，而該損傷機制是影響剩余肝臟功能的關鍵因素之一〔6〕。丹參在防治和減輕肝臟缺血再灌注損傷具有保護作用〔7，8〕，本實驗就其是否通過影響 PI3K-AKT信號傳導通路的表達而發(fā)揮保護作用方面作初步研究。

本實驗通過TUNEL法和Western印跡法可以觀察到，丹參注射液預處理組凋亡細胞數(shù)以及凋亡指數(shù)明顯下降，同時伴隨有AKT的磷酸化水平的顯著增加，而PI3K-AKT信號通路是細胞內(nèi)重要的信號轉導通路，與細胞生命活動密切相關，Akt的磷酸化正是PI3K-AKT信號通路活化，發(fā)揮抗凋亡作用的關鍵〔9〕。凋亡是導致再灌注損傷，肝臟細胞丟失的重要病理形式之一。通過干預減少再灌注肝臟細胞的凋亡有助于減輕再灌注后肝臟的損傷，促進肝臟功能恢復和保持。PI3K-AKT通路的活化后，磷酸化的Akt表達水平增加，向細胞質(zhì)或細胞核轉運，使底物蛋白特定部位的絲/蘇氨酸發(fā)生磷酸化，介導抗凋亡蛋白或蛋白激酶的調(diào)節(jié)，直接影響肝臟細胞的抗凋亡機制的活化，減少細胞凋亡。

本實驗還發(fā)現(xiàn)，與同時相SI組大鼠比較，LY組大鼠在加用阻斷劑LY294002后，肝細胞中p-Akt的表達明顯降低、肝功酶升高、肝細胞損害加重。由此可以推測，PI3K/AKT信號通路的激活可有效地抑制肝細胞凋亡發(fā)生，在大鼠肝IR損傷種起到一定的保護作用。其可能的調(diào)節(jié)機制為，丹參注射液使該通路活化，激活p-Akt，它處于這一通路的中心環(huán)節(jié)，是PI3K下游的直接靶點，傳遞由PI3K始動的信息。p-Akt可直接磷酸化前凋亡基因BAD和bax，激活抗凋亡蛋白bcl-2，防止線粒體釋放凋亡因子來促進細胞存活和抑制細胞凋亡。此外，一些具有肝保護作用的因子，如胰島素〔10〕、NO〔11〕、促紅細胞生成素〔12〕均可通過激活PI3K/AKT通路抑制細胞凋亡發(fā)揮肝臟保護作用。PI3K/AKT信號通路參與細胞營養(yǎng)代謝、存活、生長、炎癥反應和凋亡等重要生物學事件，可以降低缺血-再灌注損傷的發(fā)病率及死亡率。

本實驗中在應用特異性PI3K/Akt信號通路阻斷劑LY294002時，抑制了AKT磷酸化水平的表達，從而阻斷丹參注射液對肝臟缺血再灌注的保護作用。由此可見，丹參注射液抑制肝臟細胞的凋亡，其作用是通過激活PI3K/AKT信號通路來減少缺血再灌注損傷。

綜上所述，丹參注射液預處理對肝臟缺血再灌注引起的細胞凋亡具有抑制效應，而這種保護效應能被LY294002阻斷，故丹參注射液預處理抑制缺血再灌注肝細胞凋亡的保護效應可能與激活PI3K-AKT信號途徑有關，并且p-Akt處于這一通路的中心環(huán)節(jié)，發(fā)揮重要作用。

1 Serracino-Inglott F，Habib NA，Mathie RT.Hepatic ischemia-reperfusion injury〔J〕.Am J Surg，2001;181(1)：106.

2 趙浩亮，武小勇，李士駿，等.氧自由基在肝臟保存再灌注損傷中的作用及丹參的保護作用〔J〕.中華實驗外科雜志，2000;17(3)：237.

3 殷 濤，畢旭東，龐世剛，等.黃芪對大鼠肝缺血再灌注損傷的影響〔J〕. 中國老年學雜志，2011;31(4)：1368-71.

4 王 望，王 憲.磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信號系統(tǒng)〔J〕.國外醫(yī)學·分子生物學分冊，2000;22(1)：45-9.

5 Jaeschke H，F(xiàn)arhood A.Neutmphil and Kupffer cell-induced oxidant stress and ischemia-reperfusion injury in rat liver〔J〕.Am J Physiol，1991;260(3Pt1)：G355-62.

6 Kim Y.Ischemia-reperfusion injury of the human liver during hepatic resection〔J〕.J Hepatobiliary Pancreat Surg，2003;10(3)：195-9.

7 許繼文，付春梅.丹參的藥理作用研究進展〔J〕.醫(yī)學綜述，2006;12(23)：1467-9.

8 張淑英，陳 輝，邵小松，等.丹參注射液對兔缺血再灌注心肌損傷中細胞凋亡的影響〔J〕.江蘇醫(yī)藥，2003;29(8)：585-6.

9 Henshall DC，Araki T，Schindler CK，et al.Activation of bcl-2 associated death protein and counter-response of Akt within cellpopulations during seizure-induced neuronal death〔J〕.Neurosci，2002;22(19)：8458.

10 Rick NN，Myatt Jones J，Rafols J，et al.Insulin like growth factor-1(IGF-1)decreases ischemia-reperfusion induced apoptosis and necrosis in diabetic rats〔J〕.Endocrine，2007;31(1)：66-71.

11 Marco F，Dias-Peixoto，Robson AS.Molecular mechanisms involved in the angiotensin-(1-7)/Mas signaling pathway in cardiomyocytes〔J〕.Hypertension，2008;52(3)：542-8.

12 王文生，馬洪亮，高 洋，等.促紅細胞生成素對離體幼兔缺血再注心肌中PI3K-Akt信號通路的影響〔J〕.中國醫(yī)科大學學報，2010;39(9)：710-2.