骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制輻射誘導(dǎo)C57BL/6小鼠胸腺瘤的發(fā)生

姚月良 陳玉丙 韓志龍 王鐵君 葛立本 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院放療科，吉林 長(zhǎng)春 130041)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有干細(xì)胞特征及多向分化潛能，在特定條件下可分化為多種細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。MSCs對(duì)組織損傷具有修復(fù)及再生作用，如脊髓損傷、腦、胰腺炎、肝臟纖維化和皮膚光老化〔1～8〕，MSCs還具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤能力和降低腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等作用〔9〕。文獻(xiàn)報(bào)道X-射線照射可誘生幼齡小鼠胸腺瘤的形成〔10〕，這種輻射造成的組織損傷需要累積，甚至到老年才能觀察到癌變。因此，本研究擬應(yīng)用MSCs的組織損傷修復(fù)作用，將MsCs注射同系小鼠，觀察其對(duì)輻射誘導(dǎo)胸腺瘤形成的影響，探討輻射損傷的防治，從而預(yù)防腫瘤的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen，美國(guó))，胎牛血清(Hyclone，美國(guó))，Percoll分離液、胰蛋白酶、DAPI、CO2培養(yǎng)箱(Sigma公司，美國(guó));飛利浦深部X線放射治療機(jī)(美國(guó))。C57BL/6純系小鼠，清潔級(jí)，雌性，體重(13±2)g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 輻射誘發(fā)胸腺淋巴瘤動(dòng)物模型制備〔10〕按照Kaplan經(jīng)典方法，采用深部X射線治療機(jī)照射，電壓200 kV，電流10 mA，濾板1.0 mm Al和0.5 mm Cu。全身X射線照射，球靶距離50 cm，劑量率0.287 Gy/min，每次照射劑量1.75 Gy，每周1次，共4次，總劑量7 Gy。于末次照射后6個(gè)月殺鼠。

1.2.2 MSCs的分離、培養(yǎng)、標(biāo)記及靜注〔1～8〕處死乳鼠，無(wú)菌取股骨，DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔后，制成單細(xì)胞。應(yīng)用Percoll分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞。計(jì)數(shù)，以每瓶(4±2)×106個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換液2次。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底面積的80% ～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳到第3代備用。注射前1 d，棄去MSCs培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入DAPI工作液10 ml/瓶，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，棄去DAPI，加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)。24 h后，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞標(biāo)記情況。收集細(xì)胞，調(diào)整DAPI標(biāo)記的MSCs濃度為2.0×106個(gè)/ml，取0.5 ml經(jīng)尾靜脈注入輻射誘發(fā)胸腺瘤模型小鼠，每周1次，共4次。

1.2.3 病理學(xué)分析 取胸腺組織，10%甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，HE染色。根據(jù)胸腺瘤病理組織學(xué)特征，光鏡下觀察胸腺瘤發(fā)生率。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)分析輻射誘導(dǎo)的胸腺瘤 光鏡下觀察可見(jiàn)假照射組小鼠胸腺組織結(jié)構(gòu)正常，皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，淋巴細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈圓形或卵圓形。輻射誘導(dǎo)模型組C57BL/6小鼠正常胸腺結(jié)構(gòu)被破壞，未見(jiàn)正常淋巴細(xì)胞，淋巴樣腫瘤細(xì)胞彌漫分布，胞核大，深染，形成典型的淋巴瘤特征細(xì)胞。MSCs注射組可見(jiàn)小鼠胸腺結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)淋巴瘤特征性細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

圖1 病理學(xué)分析輻射誘導(dǎo)小鼠胸腺瘤組織(×100)

2.2 MSCs抑制輻射誘導(dǎo)小鼠胸腺瘤的發(fā)生 輻射誘導(dǎo)模型組小鼠胸腺瘤的發(fā)生率〔72.73%(8/11)〕明顯高于MSCs注射組〔20%(2/10)〕，組間比較差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

MSCs是一種成體干細(xì)胞，在特定環(huán)境下可誘導(dǎo)分化為中胚層和外胚層細(xì)胞，在組織損傷時(shí)，可歸巢至受損部位，參與組織修復(fù)和再生〔11〕。但對(duì)腫瘤的作用卻是雙向性的，一方面通過(guò)旁分泌的方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)〔12〕，將黑色素瘤 B16與MSCs一起接種于異基因C3H鼠皮下，可觀察到腫瘤生長(zhǎng)，而黑色素瘤 B16和 MSCs單獨(dú)接種，未見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)〔13〕;另一方面MSCs卻抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，將MSCs與結(jié)腸癌細(xì)胞株H1D2一起接種于小鼠皮下，7～14 d后可觀察到結(jié)腸癌生長(zhǎng)被完全抑制;MSCs還可抑制9神經(jīng)膠質(zhì)瘤大鼠模型的腫瘤生長(zhǎng)，腫瘤體積明顯小于對(duì)照組，延長(zhǎng)了大鼠的生存期〔14〕。

雖然MSCs對(duì)腫瘤的作用尚存爭(zhēng)議，但MSCs對(duì)損傷的組織確有修復(fù)作用〔1～8〕，包括電離輻射造成的損傷〔15〕。因此，本研究在應(yīng)用Kaplan方法成功建立輻射誘導(dǎo)C57BL/6小鼠胸腺瘤模型的基礎(chǔ)上，將1.0×106個(gè)同系鼠MSCs經(jīng)尾靜脈注入經(jīng)射線照射的C57BL/6小鼠體內(nèi)，在相同時(shí)間內(nèi)觀察胸腺瘤的發(fā)生率，發(fā)現(xiàn)MSCs可降低輻射誘導(dǎo)C57BL/6小鼠胸腺瘤的發(fā)生。多年研究結(jié)果表明，電離輻射的靶目標(biāo)是DNA，而DNA損傷及不正確修復(fù)是腫瘤發(fā)生的重要原因，MSCs是通過(guò)調(diào)控胸腺細(xì)胞微環(huán)境還是影響DNA損傷修復(fù)的信號(hào)傳導(dǎo)通路而降低胸腺瘤的發(fā)生，有待進(jìn)一步研究。

1 孟繁凱，陳玉丙，李光民，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在腦缺血模型大鼠腦組織中的遷徙、定居及組織修復(fù)作用〔J〕.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2007;20(12)：890-6.

2 景元海，陳玉丙，聶長(zhǎng)春，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)脊髓損傷治療作用及其機(jī)制的初步研究〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2008;28(6)：547-8.

3 姚春麗，夏建新，陳玉丙.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)豚鼠皮膚光老化的修復(fù)作用〔J〕.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2008;21(4)：315-7.

4 滕春燕，于 庭，于艷輝，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胰腺損傷模型大鼠血清生化指標(biāo)的影響〔J〕.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2009;22(3)：252-5.

5 滕春燕，于 庭，劉愛(ài)忠，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的胰島樣細(xì)胞治療大鼠胰腺損傷〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2009;29(3)：799-802.

6 滕春燕，于 庭，王春娥，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠胰腺損傷組織的修復(fù)作用〔J〕.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2009;22(4)：344-7.

7 牛鐵兵，陳玉丙，張立新.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠肝纖維化模型的修復(fù)作用〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009;5(35)：874-6.

8 姚樹(shù)智，楊有庚，陳玉丙，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在脊髓損傷模型大鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)化〔J〕.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2010;23(2)165-7.

9 Loebinger MR，Eddaoudi A，Davies D，et al.Mesenchymal stem cell delivery of TRAIL can eliminate metastatic cancer〔J〕.Cancer Res，2009;69：4134-42.

10 王洪艷，劉麗萍，龔守良，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)輻射誘發(fā)胸腺損傷修復(fù)中cyclin-D1和p53基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響〔J〕.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2011;24(2)：195-8.

11 Liu H，Kemeny DM，Heng BC，et al.The immunogenicity and immunomodulatory function of osteogenic cells differentiated from mesenchymal stem cells〔J〕.J Immunol，2006;176(5)：2864-71.

12 黃 玲，朱 偉，許文榮.間質(zhì)干細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境〔J〕.腫瘤防治研究，2010;37(6)：723-6.

13 Khakoo AY，Pati SA，Anderson SA，et al.Human mesenchymal stem cells exert potent antitumorigenic effects in a model of Kaposi's sarcoma〔J〕.J Exp Med，2006;203(5)：1235-47.

14 Fürst G，Esch JS，Poll LW，et al.Portal vein embolization and autologous CD133+bone marrow stem cells for liver regeneration：Initial experience〔J〕.Radiology，2007;243(1)：171-9.

15 Hérodin F，Mayol JF，Mourcin F，et al.Which place for stem cell therapy in the treatment of acute radiation syndrome folia〔J〕.Stem Cells，2005;43(4)：223-7.