熒光定量PCR方法檢測(cè)腦脊液中結(jié)核分枝桿菌DNA的意義

崔中鋒 史繼靜

河南省傳染病醫(yī)院 鄭州 450000

本文應(yīng)用熒光定量PCR 方法與抗酸染色、改良羅氏培養(yǎng)法進(jìn)行比較，以評(píng)價(jià)熒光定量PCR 在結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 河南省傳染病醫(yī)院2010-2011-08的住院病人。結(jié)核性腦膜炎組：根據(jù)病人臨床癥狀、體征、腦脊液的常規(guī)及生化（參照結(jié)核性腦膜炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)）［1］、頭顱CT 等診斷為結(jié)腦，并經(jīng)抗結(jié)核病治療有效者136例。其中兒童64例，男性48 例，女 性16 例。年 齡3 個(gè) 月～14 歲，平 均4.5歲；成人72例，男性30例，女性42例，年齡15～75歲，平均35.8歲。非結(jié)核性腦膜炎組（以下簡(jiǎn)稱非結(jié)腦組）：64例。

1.2 主要儀器及試劑 抗酸染色采用貝索熱染法染色液，改良羅氏培養(yǎng)采用BD 9600儀器，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增儀器采用德國(guó)羅氏公司Light icycler 480；熒光定量PCR 方法檢測(cè)TB-DNA 試劑購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

1.3 方法 采用熒光定量PCR 方法檢測(cè)結(jié)核性腦膜炎組和非結(jié)核性腦膜炎組的腦脊液中TB-DNA，按試劑盒要求取5.0×103拷貝／mL 為臨界值。結(jié)腦組同時(shí)進(jìn)行抗酸染色及改良羅氏培養(yǎng)方法檢測(cè)結(jié)核桿菌。

2 結(jié)果

結(jié)腦組和非結(jié)腦組應(yīng)用熒光定量PCR 方法、抗酸染色、改良羅氏培養(yǎng)檢測(cè)腦脊液中結(jié)核桿菌陽(yáng)性率分別為59.56%、3.68%和7.8%。見表1。

表1 2組腦脊液標(biāo)本檢驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果

為進(jìn)一步證明熒光定量PCR 方法檢測(cè)腦液中結(jié)核桿菌對(duì)結(jié)腦診斷的優(yōu)勢(shì)，對(duì)一部分病例間隔一段時(shí)間后，再次檢測(cè)1～2次。檢驗(yàn)有1次為陽(yáng)性即做為陽(yáng)性患者。經(jīng)熒光定量PCR 方法檢測(cè)結(jié)腦組不同次數(shù)的結(jié)果，分別為一次陽(yáng)性率60.3%，2次陽(yáng)性率85.4%，3次陽(yáng)性率87.5%；第1次檢測(cè)值最大6.3×106拷貝／mL，最小4.1×102拷貝／mL，平均5.34×104拷貝／mL，經(jīng)抗結(jié)核治療3周病情好轉(zhuǎn)；第2次檢測(cè)值最大8.1×105拷貝／mL，最小6.1×102拷／mL，平均為3.15×103拷貝／mL。這表明采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測(cè)TB-DNA，通過定量值的變化，能夠做結(jié)核桿菌病原菌感染的早期診斷依據(jù)，還可觀察療效。

3 討論

結(jié)腦是結(jié)核分枝桿菌引起的以腦膜炎為主的非化膿性炎癥，是最常見的嚴(yán)重肺外結(jié)核病。由于結(jié)腦患者的腦脊液做結(jié)核桿菌抗酸染色和改良羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性率較低，因而給臨床結(jié)腦的病原菌診斷帶來很大困難。因此，應(yīng)用熒光定量PCR 方法檢測(cè)腦脊液中結(jié)核菌是較為理想的方法［2］，對(duì)結(jié)核性腦膜炎的診斷有決定性意義。我院采用PCR 熒光定量方法檢測(cè)腦脊液結(jié)核桿菌的陽(yáng)性率為59.56%，與廖錦良等［3］報(bào)道的57.3%與報(bào)道的53.5%、馮恩航等報(bào)道的57.4%較接近［4］。我院對(duì)同例應(yīng)用熒光定量PCR 方法檢測(cè)2次陽(yáng)性率可達(dá)到85.4%，檢測(cè)3次陽(yáng)性率可達(dá)到87.5%，可見增加檢測(cè)次數(shù)可增加腦脊液中結(jié)核分枝桿菌的檢出陽(yáng)性率；而應(yīng)用熒光定量PCR 方法檢測(cè)非結(jié)腦組腦脊液結(jié)核桿菌的陽(yáng)性率為0，說明該方法具有很好的特異性。因而，應(yīng)用PCR 熒光定量檢測(cè)結(jié)果可比較準(zhǔn)確地指示患者腦脊液中結(jié)核桿菌的多寡，不但有較高的陽(yáng)性率，而且還具有很好的特異性和敏感性，對(duì)結(jié)核性腦膜炎不但可做病原菌診斷依據(jù)，而且還有助于指導(dǎo)患者臨床用藥和進(jìn)行療效評(píng)估，對(duì)臨床具有很好指導(dǎo)意義。因此，當(dāng)患者有結(jié)核性腦膜炎的臨床表現(xiàn)，如發(fā)熱、顱內(nèi)感染癥時(shí)，早期、多次的進(jìn)行腦脊液TB-DNA 的定量檢測(cè)是必須的。

［1］彭衛(wèi)生，王英年，肖成志.新編結(jié)核病學(xué)［M］／／孔凡元.神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1994：203-216.

［2］Tang YW，Procop GW，Persing DH.Molecular diagnostics of infectious diseases［J］.Clin Chem，1997，43（18）：2 021-2 038.

［3］廖錦良，譚耀駒，陳志成，等.Amplisensor-聚合酶反應(yīng)定量檢測(cè)腦脊液中結(jié)核分枝桿茵DNA 的研究［J］.中國(guó)防癆雜志，2001，23（4）：245-247.

［4］馮恩航，王冬梅，楊文碧，等.熒光定量PCR 方法檢測(cè)腦脊液中結(jié)核茵DNA 的臨床意義［J］，黑龍江醫(yī)學(xué)，2011，35（4）：281-282.