潰瘍性結(jié)腸炎患者血清和結(jié)腸上皮細(xì)胞中細(xì)菌鞭毛蛋白的表達(dá)*

周 川，郝卉杰，薛福敏，張建立，石朝陽，楊萬荷，仝亞林，馮百歲

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科鄭州450052

#通訊作者，男，1965年10月生，博士，教授，研究方向:炎癥性腸病，E-mail:fbs163@163.com

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未闡明。目前國外報(bào)道［1］認(rèn)為鞭毛蛋白是存在于細(xì)菌表面的絡(luò)合物的重要分子組成成分，對細(xì)菌的黏附能力和活力起著重要作用。哺乳動物體內(nèi)有受體可以識別細(xì)菌鞭毛蛋白，介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)。作者通過檢測UC 患者外周血中細(xì)菌鞭毛蛋白抗體的含量和腸黏膜細(xì)菌鞭毛蛋白的表達(dá)，探討細(xì)菌鞭毛蛋白在UC 致病中的作用，為進(jìn)一步明確IBD 的病因提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2009年9月至2010年10月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診和住院的UC 患者60例，采用Truelove 和Witts UC 分度標(biāo)準(zhǔn)［2］，中、重度UC患者30例，年齡16～55(35.2±7.5)歲;輕度UC 患者30例，年齡20～50(36.2±7.8)歲。結(jié)腸鏡下取病灶處腸黏膜活檢組織。30例健康志愿者為血清對照組，年齡22～53(31.4±8.2)歲。15例腸黏膜對照組為結(jié)腸癌行外科手術(shù)切除的正常結(jié)腸斷端，均經(jīng)病理證實(shí)，年齡28～55(40.8±8.3)歲。所有對象受試前4 個(gè)月內(nèi)均未接受氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等治療，且未合并其他自身免疫性疾病、病毒性肝炎等。研究對象均簽訂知情同意書。

1.2 血清細(xì)菌鞭毛蛋白抗體水平檢測 采受試者外周血1 mL，進(jìn)行細(xì)菌鞭毛蛋白抗體檢測，ELISA 試劑盒購自美國R＆D 公司，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 結(jié)腸上皮細(xì)胞中細(xì)菌鞭毛蛋白的表達(dá) 采用免疫組化SABC 法測定。取石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，滴加抗人細(xì)菌鞭毛蛋白一抗(美國UCL 公司產(chǎn)品，使用時(shí)稀釋100 倍)。4℃冰箱過夜，次日加入生物素二抗，DAB 顯色，各步驟之間用PBS 沖洗3 次，每次5 min，依次脫水和封片，以PBS 代替一抗作陰性對照，以已知陽性切片作陽性對照。均嚴(yán)格按試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。結(jié)果判定:高倍鏡(×400)下選擇5 個(gè)不重復(fù)視野觀察。陽性細(xì)胞百分比:0～25%為0 分，～50%為1 分，～75%為2 分，＞75%為3 分。染色強(qiáng)度:無色或黃色為1 分，棕色為2 分，褐色為3 分。以上兩項(xiàng)得分之和≥3 分為陽性，＜3 分為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0 處理數(shù)據(jù)，各組患者血清細(xì)菌鞭毛蛋白抗體水平的比較應(yīng)用單因素方差分析和SNK-q 檢驗(yàn)，結(jié)腸上皮細(xì)胞中細(xì)菌鞭毛蛋白表達(dá)的比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組患者血清細(xì)菌鞭毛蛋白抗體水平的比較見表1。

表1 各組患者血清細(xì)菌鞭毛蛋白抗體水平的比較ng/L

2.2 各組結(jié)腸上皮細(xì)胞中細(xì)菌鞭毛蛋白的表達(dá)見圖1。腸黏膜對照、輕度UC 和中、重度UC組結(jié)腸上皮細(xì)胞中細(xì)菌鞭毛蛋白表達(dá)的陽性率分別為20.0%(3/15)、56.7%(17/30)和73.3%(22/30)，3 者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 11.553，P =0.003)。其中輕度UC 和中、重度UC組高于對照組，中、重度UC組高于輕度UC組。

圖1 各組結(jié)腸上皮細(xì)胞中細(xì)菌鞭毛蛋白的表達(dá)(SABC，×400)

3 討論

IBD 是一種病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，目前，腸道細(xì)菌的感染因素已經(jīng)越來越受到重視。腸腔里存在大量種類繁多的細(xì)菌，這些細(xì)菌在正常情況下是營養(yǎng)腸道、促進(jìn)腸道發(fā)育的必需細(xì)菌，腸黏膜先天固有的免疫系統(tǒng)對其免疫耐受，若打破這種免疫耐受，則會引起腸道炎癥的發(fā)生［3-5］。運(yùn)動型的細(xì)菌都有復(fù)雜的體表細(xì)胞器和鞭毛，通過感知外界信號，協(xié)調(diào)運(yùn)動，以利于細(xì)菌的生長和生存。細(xì)菌鞭毛包括三個(gè)部分:類似于發(fā)動機(jī)功能的基部小體，扭轉(zhuǎn)的鉤狀結(jié)構(gòu)和空心的螺旋纖維(即鞭毛)［6］。鞭毛蛋白由鞭毛的中心管道分泌，在末端的螺旋結(jié)構(gòu)中組裝合成［7-8］。細(xì)菌鞭毛具有運(yùn)動、黏附、侵襲黏膜的能力，并且能夠釋放毒力因子，所以是導(dǎo)致細(xì)菌致病的重要結(jié)構(gòu)。

該研究結(jié)果顯示，UC 患者血清中的細(xì)菌鞭毛蛋白抗體水平和腸上皮中細(xì)菌鞭毛蛋白的表達(dá)較對照組增高，UC 病情越重增高越明顯，提示細(xì)菌鞭毛蛋白與UC 病情的輕重有關(guān)，細(xì)菌鞭毛蛋白可能是UC致病和炎癥持續(xù)發(fā)生的重要因素。

總之，細(xì)菌鞭毛蛋白可能參與了UC 的發(fā)病和病情進(jìn)展過程，為進(jìn)一步了解UC 的病因及其治療提供一種新的思路。

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