手術(shù)創(chuàng)傷引起的海馬炎癥反應(yīng)對(duì)老年小鼠術(shù)后認(rèn)知功能的影響*

何 龍，艾艷秋，儲(chǔ)勤軍，魯穩(wěn)梁，張 衛(wèi)

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科 鄭州450052

#通訊作者，女，1963年9月生，博士，教授，研究方向:麻醉學(xué)，E-mail:aiyanqiu82@sohu.com

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是老年人術(shù)后常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為術(shù)后記憶力、判斷力及認(rèn)知功能受損，同時(shí)伴有社會(huì)活動(dòng)能力減退［1］。POCD 的確切發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。作者觀察了老年小鼠肝臟部分切除術(shù)后認(rèn)知功能和海馬炎癥因子表達(dá)水平的變化，以探討圍術(shù)期手術(shù)創(chuàng)傷引起的神經(jīng)炎癥反應(yīng)對(duì)術(shù)后認(rèn)知功能的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選擇及分組 96 只健康雄性昆明小鼠由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，月齡16 個(gè)月，體質(zhì)量30～40 g。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組24只。對(duì)照組(NS組)腹腔注射生理鹽水0.1 mL/10 g;麻醉組(Ane組)腹腔內(nèi)注射芬太尼0.2 mg/kg、氟哌利多5 mg/kg 行動(dòng)物麻醉;假手術(shù)組(Sham組)和手術(shù)組(Sur組)采用與Ane組相同的麻醉方法行動(dòng)物麻醉，待反正反射消失后，腹部擬切口部位常規(guī)備皮消毒，于劍突下腹部正中做一2.0 cm 左右切口。Sham組打開腹腔，5 min 后，腹腔注射生理鹽水0.3 mL 補(bǔ)充液體丟失，2.5 g/L 的丁哌卡因浸潤切口，以0 號(hào)絲線分層縫合腹膜和腹壁; Sur組打開腹腔后充分暴露肝臟，棉簽抬起肝臟左外側(cè)葉，充分游離后結(jié)扎，剪下肝臟左外側(cè)葉(約占整個(gè)肝臟體積的1/3)，后續(xù)處理同Sham組。手術(shù)時(shí)間約20 min。待動(dòng)物清醒后放回鋪有棉紗布?jí)|的籠具，注意保暖。

1.2 認(rèn)知功能測(cè)試 采用Morris 水迷宮法［2］，包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分。術(shù)前進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，歷時(shí)5 d，動(dòng)物面向池壁隨機(jī)從4 個(gè)入水點(diǎn)放入水迷宮中，共4 次。尋找平臺(tái)(平臺(tái)置于Ⅰ象限，直徑10 cm，沒于水面下1 cm)最大時(shí)限設(shè)定為60 s，取當(dāng)天4 次測(cè)試結(jié)果平均值進(jìn)入最后統(tǒng)計(jì)分析。麻醉或手術(shù)后第1、3、7 天，分別從各組中隨機(jī)抽取8 只動(dòng)物進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)［即撤去平臺(tái)，選取平臺(tái)正對(duì)象限(Ⅲ象限)的中點(diǎn)為入水點(diǎn)將動(dòng)物面向池壁放入水中，自由游泳60 s］。攝像系統(tǒng)及相應(yīng)分析軟件自動(dòng)分析記錄動(dòng)物游泳軌跡、逃避潛伏期、游泳距離、游泳速度、目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比、1 min 內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)等參數(shù)。

1.3 海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白及mRNA的表達(dá)檢測(cè) 認(rèn)知功能測(cè)定完畢后，動(dòng)物麻醉下處死取腦，迅速分離海馬，置入液氮中，后轉(zhuǎn)存至－80℃低溫冰箱保存，以檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白及其mRNA 的表達(dá)水平。

1.3.1 Western blot 法檢測(cè)海馬IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白的表達(dá) 海馬組織加入RIPA 裂解液，低溫勻漿，4℃下12 000 g 離心5 min，取上清液。BCA 法測(cè)定樣品蛋白濃度。取蛋白樣品40 μg 與等體積的上樣緩沖液混合，煮沸10 min，100 g/L SDS 凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，50 g/L 脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗按(按1∶ 1 000 稀釋，英國Abcam 公司)和βactin(按1∶ 1 000 稀釋，英國Abcam 公司)，4℃孵育過夜，TBST 洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(按1 ∶ 4 000 稀釋)及鼠抗β-actin 抗體(按1∶ 5 000 稀釋)，37℃孵育2 h，TBST 洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光液X 光片曝光顯色。采用UVP 凝膠成像系統(tǒng)分析儀采集圖像，Quantity One 軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白與β-actin 灰度值的比值代表IL-1β、IL-6、TNF-α 的表達(dá)水平。

1.3.2 Real Time RT-PCR 法檢測(cè)海馬IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表達(dá) Trizol 總RNA 提取試劑盒(TaKaRa 公司)抽提總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa 公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。應(yīng)用軟件Premier 5.0 設(shè)計(jì)其擴(kuò)增引物，由大連寶生物公司合成。β-actin 上游引物序列5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，下游引物序列5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為150 bp;IL-1β 上游引物序列5’-TCCAGGATGAGGACATGAGCAC-3’，下游引物序列5’-GAACGTCACACACCAGCAGGTTA-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為105 bp; IL-6 上游引物序列5’-AAATTCGGTA CATCCTCGAC-3’，下游引物序列5’-CCTCTTTGCT GCTTTCACAC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為84 bp; TNF-α 上游引物序列5’-GTTCTATGGCCCAGACCCTCAC-3’，下游引物序列5’-GGCACCACTAGTTGGTTGTCTTTG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為175 bp。采用SYBR Green Real Time PCR 試劑盒(TaKaRa 公司)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性1 min;95℃變性30 s，58℃退火35 s，72℃延伸1 min，共40 個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。以2－ΔΔCT法計(jì)算IL-1β、IL-6及TNF-α mRNA 的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 處理數(shù)據(jù)，4組逃避潛伏期和潛伏期內(nèi)游泳總路程的比較應(yīng)用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，其他指標(biāo)的比較應(yīng)用析因設(shè)計(jì)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期及逃避潛伏期內(nèi)游泳總路程比較 見表1。各組逃避潛伏期、潛伏期內(nèi)游泳總路程隨著訓(xùn)練時(shí)間的增加而逐漸減小，同一時(shí)間點(diǎn)各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 術(shù)后游泳速度、目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比及1 min 內(nèi)穿臺(tái)次數(shù)的比較 見表2。術(shù)后第1、3、7 天，4組動(dòng)物游泳速度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比及1 min 內(nèi)穿臺(tái)次數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 4組術(shù)前逃避潛伏期、潛伏期游泳總路程的比較(n=24)

表2 術(shù)后第1、3、7 天4組動(dòng)物游泳速度、目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比及1 min 內(nèi)穿臺(tái)次數(shù)的比較(n=8)

2.3 術(shù)后第1、3、7 天4組動(dòng)物海馬IL-1β、IL-6 及 TNF-α 蛋白和mRNA 表達(dá)水平的比較 見表3、4。

表3 術(shù)后第1、3、7 天4組動(dòng)物海馬IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白的表達(dá)水平比較(n=8)

表4 術(shù)后第1、3、7 天海馬IL-1β、IL-6 及TNF-α mRNA 的表達(dá)水平比較(n=8)

3 討論

POCD 的確切病因目前尚不明確。研究［3］表明中樞炎癥反應(yīng)在與衰老有關(guān)的認(rèn)知功能減退中起重要作用，而手術(shù)創(chuàng)傷引起的炎癥反應(yīng)是圍術(shù)期發(fā)生的重要病理生理學(xué)改變。小鼠各肝葉相對(duì)質(zhì)量恒定，肝左葉切除能夠獲得恒定的切除率，損傷程度容易控制，僅切除小鼠肝左葉不會(huì)引起肝功能和機(jī)體物質(zhì)代謝障礙［4］。且有研究［5］報(bào)道針對(duì)老年小鼠手術(shù)創(chuàng)傷引起的中樞炎癥反應(yīng)較成年小鼠更為強(qiáng)烈，因此該實(shí)驗(yàn)選用老年小鼠實(shí)施肝左葉切除手術(shù)，檢測(cè)術(shù)后海馬炎癥因子表達(dá)水平和認(rèn)知功能改變，觀察手術(shù)創(chuàng)傷引起的海馬炎癥反應(yīng)對(duì)老年小鼠術(shù)后認(rèn)知功能的影響。

該實(shí)驗(yàn)中術(shù)前各組動(dòng)物逃避潛伏期、潛伏期游泳總路程隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間增加而逐漸減小，表明動(dòng)物對(duì)空間環(huán)境逐漸形成了記憶。Sur組術(shù)后認(rèn)知功能明顯受損，同時(shí)伴有海馬炎癥因子表達(dá)上調(diào)，但Sur組認(rèn)知功能下降程度和炎癥因子表達(dá)水平均高于Sham組，可能是由于Sur組的創(chuàng)傷嚴(yán)重程度高于Sham組所致。有研究［6］報(bào)道創(chuàng)傷后炎癥因子表達(dá)水平與創(chuàng)傷嚴(yán)重程度密切相關(guān)，而中樞較高濃度的炎癥因子對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能的損害可能更加嚴(yán)重［7］。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理濃度的IL-1β、IL-6、TNF-α在學(xué)習(xí)記憶過程中具有重要作用，但過量表達(dá)卻能夠?qū)е聦W(xué)習(xí)記憶功能損害; 海馬是腦內(nèi)炎癥因子受體表達(dá)的聚居區(qū)，對(duì)炎癥反應(yīng)引起的損傷更為敏感［8］。TNF-α 在炎癥反應(yīng)的起始階段和級(jí)聯(lián)放大過程中具有重要作用，參與調(diào)控細(xì)胞因子、趨化因子的釋放和中樞膠質(zhì)細(xì)胞的激活，可通過活化中樞免疫細(xì)胞、招募外周循環(huán)中的免疫細(xì)胞進(jìn)入中樞，引起神經(jīng)炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生過量炎癥因子，最終導(dǎo)致動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能障礙［9］。IL-1β 也參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)的調(diào)控過程，中樞腦組織IL-1β 持續(xù)過量表達(dá)能夠?qū)е抡J(rèn)知功能損害［10］。而IL-6 作為內(nèi)源性熱原質(zhì)，通過易化其他促炎介質(zhì)的促炎作用，加重炎癥反應(yīng)對(duì)認(rèn)知功能的損傷［11］。

綜上所述，老年小鼠肝臟部分切除術(shù)能夠引起術(shù)后認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制可能與手術(shù)創(chuàng)傷所導(dǎo)致的中樞海馬組織中炎癥因子IL-1β、IL-6 及TNF-α的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

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