不同產(chǎn)地丹參藥材HPLC指紋圖譜分析及4種菲醌類(lèi)成分含量的比較

袁 曉，高俊飛，袁 萍

(中國(guó)科學(xué)院武漢植物園，湖北武漢430074)

中藥丹參為唇形科(Labiatae)植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.)的干燥根及根莖，為常用中藥材之一［1］，主要產(chǎn)于安徽、河南、陜西、江蘇、四川、河北、山東和浙江等省。丹參藥材中主要含水溶性酚酸類(lèi)與脂溶性菲醌類(lèi)2大類(lèi)成分，但僅對(duì)這2類(lèi)成分進(jìn)行檢測(cè)，尚不足以有效控制丹參藥材的質(zhì)量。為了有效評(píng)價(jià)流通領(lǐng)域的丹參藥材質(zhì)量，已有研究者將多種儀器分析技術(shù)應(yīng)用于丹參指紋圖譜的研究，并試圖從不同角度探討丹參藥材指紋圖譜的特征性與專(zhuān)屬性［2－4］。近10年來(lái)，對(duì)丹參藥材的質(zhì)量檢測(cè)研究主要包括提取工藝和指紋圖譜2個(gè)方面。

目前，獲取指紋圖譜的主要方法有色譜法、光譜法、X射線(xiàn)衍射法和分子生物技術(shù)等，其中，色譜技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展較快、應(yīng)用較廣泛的分析方法之一。高效液相色譜(HPLC)技術(shù)通過(guò)流動(dòng)相的梯度洗脫，表征中藥材中多種化學(xué)成分的綜合信息，具有分離效能高、分析速度快等特點(diǎn)，已被廣泛用于多種植物的指紋圖譜分析［5－8］。

作者采用HPLC方法獲得7個(gè)產(chǎn)地丹參藥材的HPLC指紋圖譜，并據(jù)此初步建立了丹參藥材HPLC指紋圖譜的共有模式譜;在此基礎(chǔ)上，對(duì)來(lái)源于7個(gè)產(chǎn)地的丹參藥材中4種菲醌類(lèi)成分(包括二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA)的含量進(jìn)行檢測(cè)和分析，以期為丹參藥材的質(zhì)量檢測(cè)和真?zhèn)伪鎰e提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

于2009年10月至12月分別在山東、河北、河南、陜西、安徽、四川和甘肅7個(gè)省份采集或收購(gòu)丹參藥材，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院武漢植物園吳金清研究員鑒定。

實(shí)驗(yàn)使用的主要儀器包括L－2000型高壓液相色譜儀(日本日立公司)、萬(wàn)分之一電子分析天平(上海奧豪斯儀器有限責(zé)任公司)、JK5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(合肥金尼克機(jī)械制造有限公司)和微型植物試樣粉碎機(jī)(河北黃驊市中興儀器有限公司)。使用的二氫丹參酮Ⅰ(dihydrotanshinoneⅠ)、丹參酮Ⅰ(tanshinoneⅠ)、隱丹參酮(cryptotanshinone)和丹參酮ⅡA(tanshinoneⅡA)標(biāo)準(zhǔn)品均由湖北省藥品檢驗(yàn)所提供，乙腈為色譜純級(jí)(美國(guó)TEDIA公司)，水為雙重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制 精密稱(chēng)取二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)品適量，加入適量甲醇，分別配制成質(zhì)量濃度0.08、0.02、0.01 和0.04 mg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取4種標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1、2、5、7和10 μL進(jìn)樣，按照上述色譜條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行HPLC分析。以峰面積為縱坐標(biāo)Y、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)X繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。其中，獲得的二氫丹參酮Ⅰ的線(xiàn)性方程為Y=1 913 134 943X－11 354;丹參酮Ⅰ的線(xiàn)性方程為Y=369 303 783X－6 045;隱丹參酮的線(xiàn)性方程為Y=1 954 057 167X－6 228;丹參酮ⅡA的線(xiàn)性方程為Y=2 323 839 427X－49 154。

1.2.3 供試樣品溶液制備和HPLC分析 參照文獻(xiàn)［7－8］的方法進(jìn)行供試樣品溶液的制備。將丹參藥材粉碎后過(guò)60目篩，精密稱(chēng)定藥材粉末1.00 g，加入30 mL甲醇，混勻后置于40℃水浴中用超聲波輔助提取30 min，冷卻至室溫并用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，于6 000 r·min－1離心 10 min，取上清液，用 0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液即為供試樣品溶液。按照上述色譜條件，取供試樣品溶液直接進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC分析。

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 選取山東產(chǎn)供試樣品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6次。8個(gè)共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于2.51%，相對(duì)峰面積的RSD值均小于1.73%，表明儀器精密度達(dá)到HPLC指紋圖譜檢測(cè)的要求。

1.2.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取山東產(chǎn)供試樣品溶液6份，分別按照上述色譜條件進(jìn)樣分析。6份樣品8個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積無(wú)顯著差異，RSD值分別小于2.75%和1.43%，表明該方法重復(fù)性良好，符合HPLC指紋圖譜檢測(cè)的要求。

1.2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［9－10］的方法進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。取山東產(chǎn)供試樣品溶液6份，分別于室溫條件下放置0、2、4、6、12 和 24 h，按照上述色譜條件進(jìn)樣分析。8個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于2.71%，相對(duì)峰面積的RSD值均小于1.56%，表明在24 h內(nèi)供試樣品溶液的成分穩(wěn)定，符合HPLC指紋圖譜檢測(cè)的要求。

1.2.4.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［11］的方法進(jìn)行加樣回收率實(shí)驗(yàn)。分別精密稱(chēng)取山東產(chǎn)丹參藥材粉末1.00 g、二氫丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品約5 mg、丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)品約3 mg、隱丹參酮標(biāo)準(zhǔn)品約8 mg和丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)品約3 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后待用，按此法平行制備6份濾液，按照上述色譜條件進(jìn)樣分析。采用外標(biāo)法計(jì)算樣液中二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA的含量并計(jì)算加樣回收率，加樣回收率的平均值依次為99.5%、99.4%、101.2% 和 100.5%，RSD 值依次為 0.2%、0.1%、0.5%和 0.8%。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

根據(jù)7個(gè)產(chǎn)地丹參樣品的HPLC指紋圖譜中各共有峰的相對(duì)峰面積，計(jì)算平均比值;以各產(chǎn)地的峰面積平均值計(jì)算相關(guān)系數(shù)和夾角余弦的值。將不同產(chǎn)地丹參指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入2004版“中藥指紋圖譜相似度”軟件計(jì)算系統(tǒng)，計(jì)算其相似度。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同產(chǎn)地丹參藥材的HPLC指紋圖譜及其共有模式譜分析

通過(guò)對(duì)7個(gè)產(chǎn)地丹參供試樣品溶液的HPLC分析，對(duì)測(cè)定的峰數(shù)、峰面積值和保留時(shí)間等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行分析和比較，制定優(yōu)化的丹參HPLC指紋圖譜。7個(gè)樣品的HPLC色譜圖均有21個(gè)色譜峰，其中8個(gè)為共有特征峰(圖1)，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比后可確定4、5、6和7號(hào)峰分別為二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA。這8個(gè)共有特征峰可作為判別丹參質(zhì)量的群體特征峰，其中4號(hào)峰分離度良好、保留時(shí)間居中、峰面積穩(wěn)定，故將其作為參照峰。以4號(hào)峰為參照峰構(gòu)建的丹參藥材HPLC指紋圖譜的共有模式譜(即特征指紋圖譜)見(jiàn)圖2。

必須使H型鋼對(duì)正，不應(yīng)出現(xiàn)中心偏斜。一般施焊時(shí)先焊下部，為了補(bǔ)償這部分焊接過(guò)程中所造成的上縮，應(yīng)把H型鋼的上部間隙放大0.5～2.0mm，作為反變形量。如發(fā)現(xiàn)有缺陷，必須鏟平重焊。

2.2 不同產(chǎn)地丹參藥材HPLC指紋圖譜中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積分析

以4號(hào)峰為參照峰，經(jīng)計(jì)算獲得的7個(gè)產(chǎn)地丹參樣品HPLC指紋圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積分別見(jiàn)表1和表2。

結(jié)果表明:不同產(chǎn)地丹參樣品中同一成分的相對(duì)保留時(shí)間基本相同，RSD值均小于0.086%，表明不同產(chǎn)地丹參藥材的成分組成差異不大。而不同產(chǎn)地丹參樣品間同一成分的相對(duì)峰面積卻有較大差異，例如，甘肅產(chǎn)樣品中1號(hào)峰的相對(duì)峰面積最大(0.766)，山東和四川產(chǎn)樣品中1號(hào)峰的相對(duì)峰面積最小(僅0.003)，前者是后者的255倍，表明不同產(chǎn)地丹參樣品中同一成分的含量有明顯差異。

圖譜相似度計(jì)算結(jié)果表明:產(chǎn)自甘肅、山東、河北、河南、安徽、四川和陜西的丹參藥材的HPLC指紋圖譜與共有模式譜的相似度均較高，相似度值分別為0.916、0.932、0.926、0.973、0.948、0.922 和 0.918。

圖1 來(lái)源于7個(gè)產(chǎn)地的丹參藥材HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of medicinal materials of Salvia miltiorrhiza Bge.from seven locations

圖2 丹參藥材HPLC指紋圖譜的共有模式譜(以4號(hào)峰為參照峰)Fig.2 Common pattern of HPLC fingerprint of medicinal materials of Salvia miltiorrhiza Bge.(taking No.4 peak as the reference peak)

表1 不同產(chǎn)地丹參藥材HPLC指紋圖譜中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Table 1 Relative retention time of common peaks in HPLC fingerprint of medicinal materials of Salvia miltiorrhiza Bge.from different locations

表2 不同產(chǎn)地丹參藥材HPLC指紋圖譜中共有峰的相對(duì)峰面積Table 2 Relative peak area of common peaks in HPLC fingerprint of medicinal materials of Salvia miltiorrhiza Bge.from different locations

2.3 丹參藥材中4種菲醌類(lèi)成分的含量分析

在供試丹參藥材的HPLC色譜圖中可以確定4個(gè)色譜峰為菲醌類(lèi)成分，即4、5、6和7號(hào)峰，分別為二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和丹參酮ⅡA。來(lái)源于7個(gè)產(chǎn)地的丹參藥材中這4種菲醌類(lèi)成分的相對(duì)含量見(jiàn)表3。

由表3可見(jiàn):不同產(chǎn)地丹參藥材中這4種成分的相對(duì)含量有很大差異。由產(chǎn)地間的比較看，河南產(chǎn)丹參藥材中這4種菲醌類(lèi)成分的相對(duì)含量均最高，安徽、甘肅和陜西產(chǎn)丹參藥材中這4種成分的相對(duì)含量也均較高，而河北產(chǎn)丹參藥材中均最低。

由表3還可見(jiàn):不同產(chǎn)地丹參藥材中這4種菲醌類(lèi)成分的含量組成均有一定差異，其中，隱丹參酮含量在7個(gè)產(chǎn)地藥材中均最低;甘肅產(chǎn)丹參藥材中二氫丹參酮Ⅰ含量最高，丹參酮ⅡA含量次之;河北、河南及陜西產(chǎn)丹參藥材中均為丹參酮ⅡA含量最高，二氫丹參酮Ⅰ含量次之;山東、安徽和四川產(chǎn)丹參藥材中均為丹參酮ⅡA含量最高，丹參酮Ⅰ含量次之。

比較結(jié)果表明:不同產(chǎn)地丹參藥材中菲醌類(lèi)成分整體含量有明顯差異，且各成分間的含量比例也有明顯差異，這種差異可能與不同產(chǎn)地丹參藥材的質(zhì)量差異有關(guān)。

表3 來(lái)源于7個(gè)產(chǎn)地的丹參藥材中4種菲醌類(lèi)成分的相對(duì)含量Table 3 Relative content of four phenanthraquinone compounds in medicinal materials of Salvia miltiorrhiza Bge.from seven locations

3 結(jié) 論

研究結(jié)果表明:不同產(chǎn)地丹參藥材的HPLC指紋圖譜與其共有模式譜的相似性良好，相似度值為0.916～0.973，說(shuō)明在同一年份采集的不同產(chǎn)地丹參藥材的成分基本穩(wěn)定。

河南產(chǎn)丹參藥材中二氫丹參酮Ⅰ(0.546%)、丹參酮Ⅰ(0.356%)、隱丹參酮(0.097%)和丹參酮ⅡA(0.585%)的相對(duì)含量均高于其他產(chǎn)地，而來(lái)源于河北的丹參藥材中二氫丹參酮Ⅰ(0.045%)、丹參酮Ⅰ(0.037%)、隱丹參酮(0.028%)和丹參酮ⅡA(0.094%)的相對(duì)含量則最低，表明不同產(chǎn)地丹參藥材中有效成分含量及比例差異極大。

在丹參藥材的HPLC色譜圖中共有21個(gè)峰，其中有8個(gè)較明顯且分離度較好的共有峰，由這8個(gè)共有峰構(gòu)成了丹參藥材的HPLC指紋圖譜的共有模式譜。本方法操作簡(jiǎn)單且穩(wěn)定性良好，建議以此共有模式譜作為丹參藥材真?zhèn)伪鎰e的標(biāo)準(zhǔn)之一。

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