基于ISSR標記的62個朱頂紅品種的遺傳關系分析及指紋圖譜構建

張 林，徐迎春，成海鐘，周玉珍，婁曉鳴，呂文濤

(1.南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，江蘇南京210095;2.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，江蘇蘇州215008)

朱頂紅(Hippeastrum spp.)原產(chǎn)于中南美洲，為石蒜科(Amaryllidaceae)朱頂紅屬(Hippeastrum Herb.)所有種類的總稱，其花大色艷、葉形優(yōu)美，具有較高的觀賞價值。目前，國內朱頂紅產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，但在生產(chǎn)實踐中應用的品種主要引自荷蘭，且自主培育的新品種還處于起步階段。朱頂紅雜交品種較原種有觀賞價值高、環(huán)境適應性強等優(yōu)點，但在長期選育過程中原種已丟失，加之對引進品種的遺傳背景并不了解，無法確定大部分栽培品種的親緣關系［1］。經(jīng)過長期的人工栽培選育，朱頂紅存在較大的遺傳分化，遺傳多樣性高，采用傳統(tǒng)的分類方法很難區(qū)分其種下類群及品種［2］。

ISSR標記引物為隨機引物，無需預先知道基因組序列，具有成本低、條帶清晰且重復性好的特點。目前，ISSR 標記已用于鳶尾(Iris tectorum Maxim.)［3］、茶〔Camellia sinensis(L.)O.Ktze.〕［4］、桂花〔Osmanthus fragrans(Thunb.)Lour.〕［5］、紅麻(Hibiscus cannabinus L.)［6］、桑樹(Morus alba L.)［7］和菊花〔Dendranthema morifolium(Ramat.)Tzvel.〕［8］等植物的遺傳多樣性研究以及通過構建ISSR指紋圖譜進行品種鑒定。劉本英等［4］利用4條ISSR引物組合對40份云南大葉種茶樹種質資源進行了鑒別;李梅等［5］利用引物ISSR12和ISSR27鑒別了84份桂花種源。目前，Chakrabarty等［9］采用RAPD標記確定出部分雜交朱頂紅品種的親緣關系，但有關朱頂紅ISSR標記鑒定的相關研究尚未見報道。

作者以2個來自蘇州本地的朱頂紅品種和60個引自荷蘭的朱頂紅品種為研究對象，利用ISSR分子標記技術進行遺傳多樣性分析，以期揭示朱頂紅不同品種間的親緣關系、構建62個朱頂紅品種的ISSR指紋圖譜，為朱頂紅雜交親本的選擇以及新品種鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的62個朱頂紅品種均采集于蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院園藝中心，其中60個品種引自荷蘭，分別為‘蘋果花’(‘Apple Blossom’)、‘橙色塞維’(‘Orange Sovereign’)、‘維拉’(‘Vera’)、‘簡女士’(‘Lady Jane’)、‘瑪 麗’(‘MaryLou’)、‘卡 里 美 柔 ’(‘Calimero’)、‘紅孔雀’(‘Red Peacock’)、‘哈庫’(‘Hercules’)、‘蒙特布朗’(‘Mont Blanc’)、‘紅獅’(‘Red Lion’)、‘雙跡’(‘Double Record’)、‘薩德’(‘Pasadena’)、‘安 迪’(‘Andes’)、‘女 神 ’(‘Aphrodite’)、‘當 娜’(‘Donau’)、‘帆 船 ’(‘Benfica’)、‘所羅門’(‘Solomon’)、‘粉色精華’(‘Pink Blossom’)、‘精靈’(‘Elvas’)、‘花孔雀’(‘Blossom Peacock’)、‘舞 蹈 皇 后’(‘Dancing Queen’)、‘鳳 蝶’(‘Papilio’)、‘極 品’(‘Best Seller’)、‘雅典娜’(‘Athene’)、‘貝貝星’(‘Baby Star’)、‘波 利 舞 曲’(‘Bolero’)、‘卡 門 ’(‘Carmen’)、‘丁 克’(‘Celica’)、‘誘 惑 ’(‘Charisma’)、‘圣誕禮物’(‘Charismas Gift’)、‘小丑’(‘Clown’)、‘希望’(‘Desire’)、‘俏皮玫瑰’(‘Donau Rose’)、‘小精靈’(‘Fairytale’)、‘游戲’(‘Faro’)、‘白孔雀’(‘White Peacock’)、‘園藝師’(‘Floris Hekkere’)、‘希望’(‘Green Goddes’)、‘自由’(‘Liberty Donker’)、‘耀眼的路德維格’(‘Ludwig Dazzler’)、‘曼波樂曲’(‘Mambo’)、‘奧拉夫’(‘Olaf’)、‘奧林帕斯’(‘Olympus’)、‘帕梅拉’(‘Pamela’)、‘花邊香石竹’(‘Picotee’)、‘紅里花邊香石 竹’(‘PicoteeRedLining’)、‘雞 尾 酒’(‘Piquant’)、‘序 曲’(‘Prelude’)、‘約 翰 遜 ’(‘President Johnson’)、‘承諾’(‘Promise’)、‘快車’(‘Rapido’)、‘羅馬’(‘Roma’)、‘桑河’(‘San Remo’)、‘明 星’(‘Showmaster’)、‘蘇 珊 ’(‘Susan’)、‘珍 品’(‘Unique’)、‘火 焰 孔 雀’(‘Flaming Peacock’)、‘小紅星’(‘Xiaohongxing’)、‘阿 爾 卑 斯 之 角’(‘Matterhorn’)和‘月 光’(‘Moonlight’);另有2個品種為蘇州本地品種。每個品種采集1個單株的嫩葉，置于硅膠中干燥，帶回實驗室于4℃冰箱中保存、備用。

參考加拿大哥倫比亞大學(UBC)的引物設計ISSR引物，并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成;Taq DNA聚合酶、dNTPs和10×PCR buffer等購于寶生物工程(大連)有限公司，Marker購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;AG22331型梯度PCR擴增儀為Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 方法

采用CTAB法［10］提取基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，紫外分光光度計(日本島津公司)檢測DNA質量和濃度，并稀釋至20 ng·μL-1。ISSR-PCR擴增體系總體積20 μL，其中包含 Taq DNA 聚合酶1.0 U、模板 DNA 40 ng、10×PCR buffer 2 μL，其他成分終濃度分別為 Mg2+1.5 mmol·L-1、dNTPs 0.15 mmol·L-1、引物 0.50 μmol·L-1。擴增程序為:94℃預變性5 min;94℃ 變性40 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，38個循環(huán);最后于72℃延伸8 min。反應產(chǎn)物置于4℃條件下保存。PCR產(chǎn)物用質量分數(shù)1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 mg·L-1溴化乙錠)進行電泳檢測，電泳緩沖液為 0.5×TBE，電泳時電壓為5 V·cm-1;電泳結束后在凝膠成像系統(tǒng)儀(上海天能科技有限公司)上觀測、分析并拍照。

以形態(tài)特征差異大的朱頂紅品種的基因組DNA為模板，利用上述擴增體系和程序從100條ISSR引物中篩選適宜引物及各引物適宜的退火溫度。引物篩選條件:連續(xù)2次梯度PCR后條帶清晰且不彌散、條帶重復出現(xiàn)、具有較高多態(tài)性。適宜退火溫度則選擇適宜溫度范圍內偏高的溫度。篩選出的引物及退火溫度用于所有供試樣品的PCR擴增反應。

1.3 數(shù)據(jù)記錄與分析

根據(jù)電泳結果，記錄清晰可重復的DNA電泳條帶;對于同一引物的擴增產(chǎn)物，遷移率相同的條帶記為1個位點，同一位點上有條帶記為“1”，無條帶記為“0”。只記錄易于辨認的條帶，排除模糊不清的條帶;遷移率相同但強度不同的條帶均記為“1”［11］。采集的數(shù)據(jù)輸入Excel 2010工作表，建立表征數(shù)據(jù)矩陣;運用NTSYS-PC(2.10e版)軟件計算62個品種間的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)，并進行UPGMA聚類分析。

由于針對所有朱頂紅品種的基因組DNA用同一引物擴增出的條帶有差異，因此可以利用條帶差異進行品種鑒定。首先，針對所有供試品種，對11個引物的擴增條帶進行一一比對，選出鑒別能力強的引物;然后對由鑒別能力強的引物擴增出的電泳條帶進行形象化處理，同一位點上記為“1”的條帶用黑方塊表示、記為“0”的條帶用白方塊表示，由此構建62個朱頂紅品種的DNA指紋圖譜。

2 結果和分析

2.1 ISSR－PCR擴增結果分析

從100個ISSR引物中篩選出多態(tài)性高、重復性好的11條引物(表1)，分別以62個朱頂紅品種的基因組DNA為模板，在300～3 000 bp內共擴增出118條帶，平均每個引物擴增出10.7條帶。其中，多態(tài)性條帶109條，多態(tài)性條帶百分率高達92.4%;引物UBC834、UBC836、UBC840、UBC850 和 UBC857 的多態(tài)性條帶百分率達到100.0%;多態(tài)性條帶百分率最低的為引物UBC862，僅76.9%。由此可見，供試的62個朱頂紅品種具有較豐富的遺傳多樣性。

在11條引物中，8條引物為二核苷酸重復序列，2條引物為三核苷酸重復序列，1條引物為四核苷酸重復序列，表明朱頂紅基因組中以二核苷酸重復序列居多，其中5條是堿基A-G或G-A重復引物。在朱頂紅基因組DNA復制過程中，由于與A-G或G-A重復序列結合的靶序列可能存在滑動和不均等交換現(xiàn)象，從而較易引起引物結合位點和兩結合位點之間片段長度的差異［12］。

2.2 基于遺傳相似系數(shù)的62個朱頂紅品種的聚類結果分析

以62個朱頂紅品種的118條譜帶數(shù)據(jù)建立原始矩陣，獲得兩兩品種間的遺傳相似系數(shù)1 891個;其中，2個蘇州本地品種間的遺傳相似系數(shù)最大，達到0.842 9;品種‘安迪’與‘桑河’間的遺傳相似系數(shù)最小，僅0.371 4。基于1 891個遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA法構建了供試62個朱頂紅品種的聚類圖(見圖1)。在聚類圖上于遺傳相似系數(shù)0.63處可將62個供試品種分為 A、B、C、D、E、F 和 G 組。

表1 用于62個朱頂紅品種基因組DNA ISSR標記分析的引物序列及其擴增結果Table 1 Primer sequences used for ISSR marker analysis of genomic DNA of 62 cultivars of Hippeastrum spp.and their amplification results

A組共包含42個品種，大部分白色品種包含在此組中，包括供試品種中惟一的重瓣白色品種‘白孔雀’以及4個單瓣白色品種‘阿爾卑斯之角’、‘蒙特布朗’、‘雅典娜’和‘耀眼的路德維格’;4個單瓣白色品種僅在花瓣寬度和花瓣頂端卷曲度上有區(qū)別，其中‘雅典娜’和‘耀眼的路德維格’的形態(tài)特征極其相似。此組還包括重瓣純紅色品種‘紅孔雀’以及12個單瓣紅色品種和24個紅白相間品種。在24個紅白相間品種中，‘花邊香石竹’、‘紅里花邊香石竹’和‘約翰遜’這3個白色紅邊品種的形態(tài)特征極其相似，在圖1中被聚在一起，三者間的兩兩遺傳相似系數(shù)平均為0.814 3，處于較高水平，表明這3個品種具有較高的同源性。在供試的62個品種中，遺傳相似系數(shù)最高(0.842 9)的是編號為59號和60號的2個蘇州本地品種，在圖1中被聚在一起，表明兩者遺傳關系較近，且其形態(tài)特征幾乎完全一致，據(jù)此推測可能是早期不同地區(qū)引進的同一品種，但目前無法追尋它們的遺傳背景。

B組共包含10個品種，其中包括供試品種中惟一的綠色品種‘月光’，并與本組惟一的白色品種‘希望’聚在一起，兩者遺傳相似系數(shù)達到0.800 0，表明綠色品種與白色品種的遺傳關系較近，這與已知朱頂紅花色遺傳背景規(guī)律之一的“綠色和白色的花都沒有色素表達［13］”相符。此組還包含3個紅邊白條紋品種‘曼波樂曲’、‘雞尾酒’和‘承諾’，其中‘曼波樂曲’和‘雞尾酒’在形態(tài)上極其相似。另外還包含1個紅色重瓣品種‘丁克’和4個紅色品種‘當娜’、‘奧林帕斯’、‘小紅星’和‘波利舞曲’，其中‘當娜’、‘奧林帕斯’和‘小紅星’3個品種被聚在一起，可能是由于地域或來源一致等原因而具有較近的遺傳關系。

除上述2組外，其他幾組包含的品種均較少。C組包含‘鳳蝶’和‘卡門’2個品種，其中‘鳳蝶’具有花型花色較獨特及可常綠越冬等優(yōu)良性狀，是較原始的育種材料，與多數(shù)雜交種有親緣關系，目前仍然是朱頂紅育種的重要親本之一。D組只包含‘橙色塞維’1個品種，是較常見的單瓣紅色品種。E組包含‘安迪’、‘精靈’和‘圣誕禮物’3個品種，雖然聚在一起，但它們的遺傳相似系數(shù)均不大，‘安迪’和‘精靈’是重瓣紅白相間品種，而‘圣誕禮物’是供試品種中惟一不包含在A、B兩個大組中的單瓣白色品種。F組包含‘維拉’、‘舞蹈皇后’和‘俏皮玫瑰’3個品種，其中‘維拉’是較少見的全粉色品種。G組只包含‘小丑’1個品種，是觀賞性較高的單瓣紅白條紋品種。

從聚類圖中還可見:雖然供試的62個品種并沒有按照地域區(qū)分，也不是簡單地按照花瓣單重瓣及花色分組，但是有很多形態(tài)極其相似的品種被聚在一起，表明基于ISSR標記對朱頂紅品種進行遺傳關系分析是可行的。

2.3 ISSR指紋圖譜的構建

2.3.1 特異標記確定 上述實驗結果表明:供試的62個朱頂紅品種的ISSR-PCR擴增產(chǎn)物多態(tài)性很高，僅有1個品種有1條特異性條帶，也僅有1個品種有1條特異缺失條帶(圖2)。在引物UBC873擴增圖譜上，品種‘小紅星’在450 bp處有1條特異性條帶，此條帶可用于品種‘小紅星’的鑒定;在引物UBC835的擴增圖譜上，品種‘精靈’在3 000bp處有1條特異缺失條帶，這一缺失條帶可用于品種‘精靈’的鑒定。

圖1 基于ISSR標記的62個朱頂紅品種的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA cluster dendrogram of 62 cultivars of Hippeastrum spp.based on ISSR marker

2.3.2 指紋圖譜構建 由于ISSR引物的多態(tài)性，采用同一引物擴增出的62個朱頂紅品種的條帶有明顯差異。比對結果表明:利用引物UBC835可以鑒別出50個朱頂紅品種，利用引物UBC873可以鑒別出44個朱頂紅品種，而采用引物UBC835和UBC873組合可以鑒別出供試的62個朱頂紅品種。

對上述2個引物的擴增圖譜進行形象化處理，在某一位點上有條帶的用黑方塊表示，無條帶則用白方塊表示，組合成供試62個品種的指紋圖譜(圖3)，利用此指紋圖譜，可以鑒定出使用特異性標記不能鑒別出的品種。

圖2 朱頂紅品種‘小紅星’和‘精靈’的ISSR標記特異譜帶Fig.2 Specific bands of ISSR marker for cultivars‘Xiaohongxing’and‘Elvas’of Hippeastrum spp.

圖3 基于引物UBC835和UBC873擴增結果的62個朱頂紅品種基因組DNA的ISSR指紋圖譜Fig.3 ISSR fingerprint of genomic DNA of 62 cultivars of Hippeastrum spp.based on amplification result by primers UBC835 and UBC873

3 討 論

目前，關于朱頂紅品種的遺傳背景知之甚少。本研究結果顯示:62個朱頂紅品種的ISSR片段多態(tài)性較高，不同品種間遺傳相似系數(shù)差異較大，說明在長期的進化過程中，朱頂紅品種在DNA分子水平上形成并保持了較高的變異，這可能與朱頂紅某些品種存在自交不結實現(xiàn)象有關。朱頂紅作為母本時的結實能力在一定程度上反映了該品種的園藝化程度，即越是原始的品種其結實能力越強，而經(jīng)過多次雜交和人工繁殖的品種其結實能力減弱。呂文濤等［14］對朱頂紅不同雜交和自交組合的研究結果表明:品種‘蘋果花’和‘粉色精華’作為母本時不結實，說明它們是園藝化程度比較高的品種，在多次反復雜交過程中，作為母本它們的結實能力下降到幾乎為零的水平;而品種‘貝貝星’、‘鳳蝶’、‘橙色塞維’、‘紅獅’、‘哈庫’和‘所羅門’作為母本時在雜交和自交的情況下均可結實，說明這6個品種是相對比較原始的朱頂紅品種。本研究結果表明:品種‘鳳蝶’與其他61個品種的遺傳相似系數(shù)平均值為0.655 4，而園藝化程度較高的品種‘蘋果花’為0.606 9，說明品種‘鳳蝶’在朱頂紅的園藝化過程中發(fā)揮了重要作用。

從聚類分析結果看，供試的62個朱頂紅品種沒有完全按照花的單重瓣特性或花色聚類，而基本上是根據(jù)遺傳相似系數(shù)混合聚成7組，但有許多形態(tài)極其相似的品種被聚在一起，表明基于ISSR標記對朱頂紅品種進行遺傳多樣性分析是可行的?！ㄟ呄闶瘛?、‘紅里花邊香石竹’和‘約翰遜’3個品種形態(tài)特征完全一致，很難辨別，利用ISSR標記得到三者的兩兩遺傳相似系數(shù)均為0.814 3，在聚類圖中聚在一起，與其形態(tài)特征具有一致性?；ㄇo較高較粗的朱頂紅品種‘蒙特布朗’和‘阿爾卑斯之角’以及花莖較細的朱頂紅品種‘雅典娜’、‘圣誕禮物’和‘希望’的花型及其花色等特征完全一致，平均遺傳相似系數(shù)分別為0.742 9和0.785 7，在62個品種間處于較高的水平。分析結果表明:在供試的62個朱頂紅品種中，白色單瓣品種中形態(tài)特征一致的品種均具有較高的遺傳相似系數(shù)(約0.8)，表明它們具有一定的遺傳相似性。因而，在實際引種時應避免引進形態(tài)類似的品種。另外，建議可將遺傳相似系數(shù)作為新品種確定的依據(jù)之一，遺傳相似系數(shù)大于一定數(shù)值的(如0.8以上)在確定新品種時應慎重。

在生產(chǎn)實踐中應用的朱頂紅栽培品種在園藝性狀上具有一定的差別，通常根據(jù)花色、花型和株型等特征進行區(qū)分。但很多形態(tài)相似品種從外部形態(tài)特征上根本無法鑒別，不僅花色花型一致，而且受栽培條件影響較大，其花期和葉片數(shù)等特征也幾乎無差別。本研究篩選出2個特異性條帶可以分別鑒別品種‘小紅星’和‘精靈’，而利用2個多態(tài)性高、重復性好的ISSR引物(UBC835和UBC873)構建的指紋圖譜可以鑒別供試的62個品種。目前，運用ISSR標記進行品種鑒定已具有極大的應用前景，但在實際運用過程中，應對朱頂紅品種進行進一步的研究以期篩選出更多的特異性條帶，特別是應注重形態(tài)相似品種間的特異性條帶篩選，使這一鑒定方法的應用范圍更大、鑒定結果更準確和快捷。

致謝:蘇州大學蠶絲生物技術實驗室為本研究提供實驗條件，謹此致謝!

［1］BELL W D.New potentials in Amaryllis breeding［J］.Florida State Horticultural Society，1973，86:462-466.

［2］MEEROW A W，KANE M E，BROSCHAT T K.Breeding of new Hippeastrum cultivars using diploid species:the F-1 evaluation［J］.Florida State Horticultural Society，1990，103:168-170.

［3］張 敏，黃蘇珍，仇 碩，等.鳶尾屬植物遺傳多樣性的RAPD和ISSR分析［J］.植物資源與環(huán)境學報，2007，16(2):6-11.

［4］劉本英，王麗鴛，周 健，等.云南大葉種茶樹種質資源ISSR指紋圖譜構建及遺傳多樣性分析［J］.植物遺傳資源學報，2008，9(4):458-464.

［5］李 梅，侯喜林，單曉政，等.部分桂花品種親緣關系及特有標記的ISSR分析［J］.西北植物學報，2009，29(4):674-682.

［6］鄭海燕，粟建光，戴志剛，等.利用ISSR和RAPD標記構建紅麻種質資源分子身份證［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2010，43(17):3499-3510.

［7］ZHAO W G，MIAO X X，ZANG B，et al.Constrction of fingerprinting and genetic diversity of Mulberry cultivars in China by ISSR Markers［J］.Acta Genetica Sinica，2006，33(9):851-860.

［8］繆恒彬，陳發(fā)棣，趙宏波.85個大菊品種遺傳關系的ISSR分析［J］.園藝學報，2007，34(5):1243-1248.

［9］CHAKRABARTY D，GUPTA V N，DATTA S K.Varietal identification and assessment of genetic relationships in Hippeastrum using RAPD markers［J］.Plant Biotechnology Reports，2007，1:211-217.

［10］DOYLE J J，DOYLE J L.Isolation of plant DNA from fresh tissue［J］.Focus，1990，12:13-15.

［11］鞏振輝.園藝植物生物技術［M］.北京:科學出版社，2009.

［12］CAMACHO F J，LISTON A.Population structure and genetic diversity of Botrychium pumicola(Ophioglossaceoe)based on inter-simple sequence repeats(ISSR)［J］.American Journal of Botany，2001，88(6):1065-1070.

［13］呂英民，王有江.朱頂紅［M］.北京:中國林業(yè)出版社，2004:16-58.

［14］呂文濤，成海鐘，周玉珍，等.朱頂紅人工授粉的結實率與出苗率研究初報［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2010(1):185-187.