不同產(chǎn)地及株齡果用銀杏葉中總銀杏酸含量的比較

姚 鑫，周桂生，唐于平，錢大瑋，宿樹蘭，段金廒

(南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省方劑高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇南京210046)

銀杏(Ginkgo biloba L.)是中國特有的集葉用、果用、材用、防護和觀賞于一體的多功能樹種。銀杏葉和果實具有獨特的藥理效應(yīng)，廣泛應(yīng)用于食品、保健品、化妝品和藥品中，已逐漸成為全球植物藥制劑與保健食品的前列品種。銀杏葉為銀杏的干燥葉，其提取物制劑在臨床上用于治療冠心?。?］、高血壓［2］、腦梗死［3］、癡呆［4－5］、哮喘［6］、乙型肝炎［7］和糖尿?。?］等疾病。銀杏葉主要含黃酮類和萜內(nèi)酯類成分，還含有銀杏酸類成分。銀杏酸類成分具有致敏性、細胞毒性和免疫毒性等，是銀杏葉提取物及其制劑中的主要毒性成分，因此，銀杏酸的限量是評價銀杏葉制劑質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)之一［9］。

葉用銀杏主要為株齡4～7 a的植株，由于存在氣溫差異，7月份至9月份銀杏葉中黃酮和萜內(nèi)酯含量均較高，采葉較為適宜，可作為銀杏提取物的原料［10－11］;銀杏大多生長9～10 a后結(jié)果，但10月份采果后，大量的銀杏葉因黃酮與萜內(nèi)酯類成分含量偏低［12－13］而被廢棄。筆者前期的研究結(jié)果表明:果用銀杏的落葉中黃酮類與萜內(nèi)酯類成分含量不高，且其組成變化不大［14］，如果通過富集利用也可能成為銀杏葉提取物的原料，但其中銀杏酸含量則未知。

筆者采用 HPLC 方法［9，15－16］，對不同產(chǎn)地及株齡果用銀杏葉中銀杏酸含量的變化進行比較分析，以期為果用銀杏葉資源的深度開發(fā)利用提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

以2011年10月果實收獲后的銀杏葉為實驗材料，分別采自位于山東郯城和泰安，江蘇揚州、南京和泰興，廣西靈川，浙江安吉，安徽寧國，湖南永州，福建長汀，河北石家莊，貴州遵義和貴陽，遼寧丹東，河南洛陽以及四川成都和南臺的銀杏栽培區(qū)，每個產(chǎn)地收集1個樣品(500 g);其中，在山東郯城分別選株齡10、15、20、25、30、50 和 100 a 的樣株采集樣葉，其余產(chǎn)地樣株的株齡均為20 a。樣品經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)輝博士鑒定為銀杏的干燥葉，樣本存放于南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省方劑高技術(shù)研究重點實驗室。樣品采集后于45℃烘干，粉碎后過40目篩，備用。

主要儀器:Waters 2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)、BT－125D型十萬分之一電子分析天平(德國Satorius公司)、KH－2200B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)、Anke GL－16G－Ⅱ高速冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)和EPED－T純水器(南京易普易達科技發(fā)展有限公司)。

供含量測定用的白果新酸對照品(批號:111690－200702)及供鑒別用的總銀杏酸對照品(批號:111594－200603)均由中國藥品生物制品鑒定所提供;甲醇為色譜純(江蘇漢邦科技有限公司)，水為自制超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取白果新酸對照品適量，加甲醇配制成質(zhì)量濃度0.162 0 mg·mL－1的對照品溶液。另取總銀杏酸對照品適量，作為鑒別用對照品溶液。

分別精密吸取白果新酸對照品溶液 1.0、2.0、4.0、8.0、16.0和32.0 μL，參照文獻［9］的色譜條件進行 HPLC 測定。以對照品進樣量(μg)為橫坐標(biāo)X、峰面積積分值為縱坐標(biāo)Y進行線性回歸分析，得到回歸方程Y=5.24×105X－5.01×104(r=0.999 9)，顯示白果新酸進樣量在 0.162 ～5.184 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.2.2 供試品溶液的制備及測定 取銀杏葉粉末約1.0 g，精密稱定后準(zhǔn)確加入20 mL甲醇，閉塞并稱取質(zhì)量，用超聲波輔助提取45 min(超聲功率40 kHz)，冷卻后再稱取質(zhì)量并用甲醇補足損失的質(zhì)量，搖勻后用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液即為供試品溶液。每個樣品取3份，平行提取。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的色譜條件進行HPLC分析，每份樣品測定3次，并采用外標(biāo)法以白果新酸對照品計算總銀杏酸含量。

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 精密度實驗 精密吸取同一對照品溶液20 μL，按上述色譜條件重復(fù)進樣測定6次，其峰面積的RSD為0.67%，表明儀器精密度良好。

1.2.3.2 重復(fù)性實驗 取同一批銀杏葉，制備6份供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，白果新酸和總銀杏酸含量分別為0.114%和1.03%，RSD 分別為1.75%和1.59%，表明本方法重復(fù)性較好。

1.2.3.3 穩(wěn)定性實驗 取重復(fù)性實驗中的供試品溶液1份，分別于0、4、8、12和24 h按上述色譜條件進樣測定，白果新酸和總銀杏酸的RSD分別為0.87%和1.00%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

1.2.3.4 回收率實驗 取總銀杏酸含量已知的樣品6份，每份約0.5 g，精密稱定后按照供試品溶液的制備方法處理并按上述色譜條件進樣測定，平均回收率為99.7%，RSD為1.7%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果和分析

2.1 總銀杏酸的HPLC分析結(jié)果

采用文獻［9］的HPLC色譜條件及方法，果用銀杏葉中5種主要銀杏酸成分均得到較好的分離，對照品及樣品的HPLC色譜圖見圖1。

2.2 不同株齡果用銀杏葉總銀杏酸含量的比較

來源于山東郯城的不同株齡果用銀杏葉中總銀杏酸含量的測定結(jié)果見表1。由表1可見:不同株齡果用銀杏葉中總銀杏酸含量有一定差異，其中，總銀杏酸含量在株齡50 a的銀杏葉中最高(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.20%)，在株齡25 a的銀杏葉中最低(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.81%)。株齡10～30 a的銀杏葉中總銀杏酸含量均低于質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，而株齡50或100 a的銀杏葉中總銀杏酸含量均高于質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%。一般認(rèn)為，葉用銀杏葉中總銀杏酸含量為0.48% ～2.52%［9］，與此相比，來源于山東郯城不同株齡果用銀杏葉中總銀杏酸含量相對較低。

圖1 銀杏酸對照品及銀杏葉樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of ginkgolic acid standard and Ginkgo biloba L.leaf sample

表1 不同株齡果用銀杏葉中總銀杏酸含量的測定結(jié)果Table 1 Determination result of total ginkgolic acids content in leaf of fruit-utilization type of Ginkgo biloba L.with different tree ages

2.3 不同產(chǎn)地果用銀杏葉中總銀杏酸含量的比較

來源于12個省區(qū)17個產(chǎn)地的果用銀杏葉中總銀杏酸含量的測定結(jié)果見表2。由表2可見:各產(chǎn)地果用銀杏葉中總銀杏酸含量差異較大。其中，福建長汀產(chǎn)果用銀杏葉中總銀杏酸含量最高(質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.80%)，遠超過文獻［9］報道的葉用銀杏葉中總銀杏酸的含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.48% ～2.52%);江蘇及其周邊的山東、安徽、浙江等產(chǎn)地的果用銀杏葉中總銀杏酸含量均較低(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.51% ～0.99%)，顯示出果用銀杏葉中總銀杏酸含量具有一定的區(qū)域性。

表2 來源于不同產(chǎn)地果用銀杏葉中總銀杏酸含量的測定結(jié)果Table 2 Determination result of total ginkgolic acids content in leaves of fruit-utilization type of Ginkgo biloba L.from different locations

3 討論和結(jié)論

研究結(jié)果表明:果用銀杏葉中銀杏酸的含量因株齡和產(chǎn)地有較大差異。從株齡看，10～30 a生果用銀杏葉總銀杏酸含量偏低，50 a生果用銀杏葉總銀杏酸含量最高;按地區(qū)分布，來源于江蘇及其周邊山東、安徽和浙江等地的果用銀杏葉中總銀杏酸含量較低，而來源于福建長汀的果用銀杏葉中總銀杏酸含量最高。因此，在果用銀杏葉利用過程中，除考慮其中銀杏黃酮和萜內(nèi)酯含量相對較高外，還應(yīng)根據(jù)“總銀杏酸含量較低”這一標(biāo)準(zhǔn)選擇適宜的株齡和產(chǎn)地。

采用多層次成分富集技術(shù)，有望將果用銀杏葉開發(fā)成為與銀杏葉提取物相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品，并應(yīng)用于醫(yī)藥與食品領(lǐng)域，為銀杏的綜合利用與開發(fā)提供新資源。

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