活血解毒益氣方含藥血清對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌ICAM-1、MCP-1的影響

彭 哲 祝光禮 劉 昭 杭州市中醫(yī)院心內(nèi)科 杭州 310007

行俊柱 杭州市余杭區(qū)第二醫(yī)院

王春林 浙江省衢州中醫(yī)院

目前，經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）已發(fā)展成為一種成熟的介入性治療手段，血管內(nèi)皮損傷、失調(diào)是再狹窄發(fā)生的啟動及促進(jìn)因素[1]。有資料顯示[2]，再狹窄是局部血管損傷后的一種修復(fù)反應(yīng)，是多種細(xì)胞因子、趨化因子介導(dǎo)的局部血管重建和再塑，與內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)主要觀察活血解毒益氣方含藥血清對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）分泌ICAM-1、MCP-1的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動 物 健康新西蘭兔35只，體質(zhì)量1.8～2.3kg，均為雄性，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。許可證號：SCXK（浙）2005-0022

1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 ECV304細(xì)胞株，浙江大學(xué)陳哲博士惠贈。

1.3 藥 物 活血解毒益氣方，由半枝蓮、丹參、金銀花、牡丹皮、生黃芪等組成，由杭州市中醫(yī)院制劑室制備，濃度為3g生藥/mL。普伐他汀20mg，由中美上海施貴寶制藥有限公司提供，批號0603056，每片20mg，動物按1.5mg/kg給藥，用雙蒸水溶解制備成混懸液。

1.4 儀器與試劑 電熱恒溫水浴箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫二氧化碳細(xì)胞孵育箱：NApco-Model54i0；precisionscien 酶 標(biāo) 儀 ：Elxs（X）BioelisaReader，Bio klnstruments INC；USA Olympus倒置顯微鏡：Nikon Japan。

ICAM-1 ELISA試劑盒、MCP-1 ELISA試劑盒均為 Rapidbio company，USA產(chǎn)品，購自杭州浩仁科技有限公司，批號0214562；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、EDTA、噻唑藍(lán)（MTT）均為美國Sigma產(chǎn)品；二甲基亞砜為北京化工廠產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制備方法及含藥血清制備 取7只兔設(shè)為正常組，其余28只隨機(jī)分為模型組、普伐他汀組和活血解毒益氣方大、小劑量組，各7只，建立兔PTA術(shù)后血管損傷模型[3]。從造模前3天開始，給藥組兔分別予活血解毒益氣方大、小劑量和普伐他汀灌胃給藥，給藥劑量根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”[4]計(jì)算，以臨床等效劑量為小劑量，4倍于臨床等效劑量為大劑量。正常組7只和模型組予生理鹽水灌胃。各給藥組劑量分別為活血解毒益氣法大劑量組40g/kg，小劑量組10g/kg，普伐他汀組1.5mg/kg。造模成功，各給藥組繼續(xù)給藥15天后，耳背動脈無菌條件下取血，56℃滅活30min，過0.22μm濾膜過濾除菌后，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，作為含藥血清?/p>

2.2 含藥血清干預(yù)實(shí)驗(yàn) 取生長狀況良好的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，用0.1%胰蛋白酶和0.1%EDTA消化液消化后，以含10%胎牛血清的DMEM將細(xì)胞稀釋至3×104/mL，將細(xì)胞接種96孔培養(yǎng)板中。次融合狀態(tài)后，用0.5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)24h，使之細(xì)胞同步G0/G1期，分別用10%含藥血清作用24、48h后，收集上清液，進(jìn)行指標(biāo)檢測。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均分為正常組、模型血清組、普伐他汀血清組、活血解毒益氣方大、小劑量血清組，每組7個(gè)復(fù)孔。

2.3 觀察指標(biāo)與方法 細(xì)胞上清液ICAM-1檢測方法，采用雙抗夾心ELISA法。細(xì)胞上清液MCP-1檢測方法，采用雙抗夾心ELISA法。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0軟件包，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)后以（±s）表示。均數(shù)間的比較經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后以單因素方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組HUVECs培養(yǎng)上清液ICAM-1含量比較24h結(jié)果顯示，活血解毒益氣方大、小劑量組和普伐他汀組均能顯著降低HUVECs分泌ICAM-1，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。48h結(jié)果顯示，普伐他汀組、活血解毒益氣大、小劑量組抑制HUVECs分泌ICAM-1的作用穩(wěn)定，與48h的模型組比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組細(xì)胞上清液中ICAM-1含量比較（±s） ng/mL

表1 各組細(xì)胞上清液中ICAM-1含量比較（±s） ng/mL

注：與模型組比較，△P＜0.05

n/只777 7 7 24h 0.920±0.117△1.177±0.060 0.959±0.082△0.986±0.088△0.981±0.123△48h 0.717±0.061△0.862±0.120 0.778±0.077△0.782±0.084△0.733±0.052△組 別正常組模型組普伐他汀組活血解毒益氣方小劑量組活血解毒益氣方大劑量組

3.2 各組HUVECs培養(yǎng)上清液MCP-1含量比較24h、48h結(jié)果顯示，活血解毒益氣方大、小劑量組和普伐他汀組均能顯著降低HUVECs分泌MCP-1，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。普伐他汀組和各中藥組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組細(xì)胞上清液中MCP-1含量比較（±s） pg/mL

表2 各組細(xì)胞上清液中MCP-1含量比較（±s） pg/mL

注：與模型組比較，△P＜0.05

120.654±19.965△414.737±46.582 260.651±72.475△274.052±58.190△181.519±53.518△7 7 7 7 7 108.131±25.567△727.624±66.249 265.299±74.933△288.988±85.715△190.2466±60.893△正常組模型組普伐他汀組活血解毒益氣方小劑量組活血解毒益氣方大劑量組

4 討論

炎性反應(yīng)是PTCA術(shù)后再狹窄的重要機(jī)制，反應(yīng)水平越高，再狹窄的危險(xiǎn)性就越大。PTCA術(shù)后，由于冠狀動脈內(nèi)膜的機(jī)械性損傷，引起血管內(nèi)皮功能受損，活化的內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種黏附分子如ICAM-1等[5]，促使白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附及活化，活化的白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞又可釋放一系列趨化因子，如MCP-1等，一方面促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，使上述黏附分子表達(dá)進(jìn)一步增加。近年來，已經(jīng)證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)MCP-1，可吸引單核細(xì)胞黏附和浸潤動脈壁[6]，且趨化性細(xì)胞因子能促進(jìn)白細(xì)胞游走和活化，參與血管炎癥反應(yīng)，啟動血管壁重建，對術(shù)后再狹窄亦產(chǎn)生重要影響[7]。

在本實(shí)驗(yàn)中，模型組ICAM-1及MCP-1水平均較正常組明顯升高（P＜0.05），表明PTA術(shù)后炎癥反應(yīng)明顯。研究證實(shí)[8]，普伐他汀除調(diào)脂作用外，還有抗炎作用。而本實(shí)驗(yàn)也觀察到普伐他汀組ICAM-1及MCP-1水平較模型組明顯降低，再次證明了普伐他汀具有抗炎作用。中藥活血解毒益氣方大、小劑量組ICAM-1及MCP-1水平較模型組明顯降低（P＜0.05），大劑量組較小劑量組降低ICAM-1更為顯著，與普伐他汀組無明顯差異。解毒活血益氣方由半枝蓮、丹參、黃芪等組成。半枝蓮清熱解毒；丹參活血化瘀；黃芪益氣以補(bǔ)正虛之不足。藥理研究表明，方中藥物具有抗病原微生物、抗炎、降脂、降低血小板黏附、抗血栓、抗氧化損傷等多種作用。中藥活血解毒益氣方大、小劑量組能通過抑制與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的重要介質(zhì)趨化因子MCP-1、黏附分子ICAM-1的分泌，進(jìn)而減輕PTCA術(shù)后病變局部炎性細(xì)胞的浸潤，抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕由此引起的血管重塑、再狹窄。

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