非清髓預處理后自體外周血造血干細胞移植治療難治性重癥肌無力遠期療效觀察

葉寶東 邵科釘 陳丹 張宇 吳迪炯 周郁鴻 沈一平 俞慶宏 沈建平

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種影響神經(jīng)－肌肉傳遞的獲得性自身免疫病，表現(xiàn)為局部或全身肌肉的無力及疲勞癥。多數(shù)患者使用免疫抑制、胸腺切除、抗膽堿酯酶藥、免疫球蛋白、血漿置換等治療后可獲得長期緩解［1］。然而仍有少數(shù)難治性MG患者對常規(guī)治療無效，嚴重影響生活質量，極易出現(xiàn)MG危象而危及生命。自體造血干細胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplantation，auto-HSCT)是治療難治性MG的有效方法之一，其遠期療效報道較少。我們觀察了浙江省中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院2005年2月至2010年2月期間采用非清髓預處理方案行純化的CD34+細胞auto-HSCT治療5例難治性MG患者的遠期療效，報道如下。

1 對象與方法

1．1 對 象

5例MG患者符合以下難治性MG定義［2］:(1)免疫抑制劑依賴，減小劑量即復發(fā);(2)免疫抑制治療后臨床癥狀不能控制;(3)免疫抑制劑不良反應較大，難以耐受。2005年2月至2010年2月期間采用FAC預處理方案行純化的自體外周血CD34+細胞移植的難治性MG患者5例，均為女性，中位年齡36(27～47)歲，中位病程3(1～22)年。5例患者移植前均使用抗膽堿酯酶藥和多種免疫抑制劑、大劑量靜脈用免疫球蛋白沖擊和血漿置換等治療，但不能控制癥狀，其中有4例已行胸腺瘤切除術。4例患者因多次MG危象出現(xiàn)嚴重呼吸衰竭而行氣管插管、呼吸機輔助通氣治療，其中1例因1年內(nèi)2次行氣管切開術，一直未封管至移植前。5例患者在行干細胞動員前均有肌力明顯下降表現(xiàn)，肌力為Ⅱ～Ⅲ級，有吞咽困難、進食嗆咳、呼吸困難等癥狀，肌疲勞試驗陽性，肌電圖呈重頻刺激遞減現(xiàn)象。4例患者乙酰膽堿受體抗體和胸腺瘤相關抗體陽性。3例CMV抗原陽性者予以更昔洛韋治療后轉陰。

1．2 外周血造血干細胞動員、采集及CD34+細胞分選

采用環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)4 g/m2，分2 d 給藥;粒細胞集落刺激因子5 ～10 μg·kg－1·d－1，從白細胞數(shù)跌至最低日開始使用至干細胞采集結束當天。當外周血白細胞數(shù)達(2～4)×109/L以上，單核細胞占全部白細胞的21% ～30%時，用血細胞分離機(COBE SPECTRA，美國金寶公司)采集外周血造血干細胞，循環(huán)血量為自身全血容量的2倍左右，根據(jù)移植需要每例患者采集2～3次。外周血采集物在采集后24 h內(nèi)進行CD34+細胞分選，將采集物與抗CD34抗體(人源，德國美天旎生物技術公司)充分混合后，應用細胞分選儀(Clini MACS，德國美天旎生物技術公司)進行CD34+細胞分選、計數(shù)，將純化后的CD34+細胞按比例加入干細胞低溫凍存保養(yǎng)液(5%二甲基亞砜，5%人血白蛋白，肝素10 U/mL)，CD34+細胞終濃度為(4～5)×109/L，按每袋50 mL分裝，－80℃冰箱冷凍保存。

1．3 預處理方案

使用非清髓預處理(改良FAC)方案:磷酸氟達拉濱(fludarabine)30 mg·m－2·d－1，共 4 d;抗胸腺細 胞 球 蛋 白 (antithymocyte globulin，ATG)2．5 mg·kg－1·d－1或抗淋巴細胞球蛋白(antilyphocyte globulin，ALG)30 mg·kg－1·d－1，共 4 d;Cy 50 ～60 mg·kg－1·d－1，共 2 d。移植均在干細胞動員后1～2個月進行。

1．4 CD34+細胞的回輸及其他用藥

于預處理結束后48 h回輸自體外周血CD34+細胞。取出－80℃冰箱冷凍保存的CD34+細胞置于42℃水浴箱解凍，回輸前予地塞米松5 mg靜脈推注，CD34+細胞在解凍后10～15 min內(nèi)從靜脈輸注。留取標本進行臺盼藍染色計算活細胞數(shù)。移植后第2天開始予粒細胞集落刺激因子每天5μg/kg皮下注射，至中性粒細胞計數(shù)達0．5×109/L以上時停用。移植后所有患者繼續(xù)原潑尼松、溴吡斯的明治療。在造血功能恢復后，根據(jù)臨床癥狀緩解程度，再逐漸減少潑尼松、溴吡斯的明用量，直至停用。

1．5 動態(tài)監(jiān)測指標

移植后動態(tài)監(jiān)測患者的血常規(guī)變化，觀察造血恢復;于移植前及移植后第1、6、12個月時采集血標本，進行自身免疫抗體檢測，同時應用流式細胞儀檢測外周血淋巴細胞亞群表達，T淋巴細胞選擇CD3、CD4、CD8，B淋巴細胞選擇 CD19，NK細胞選擇CD16、CD56。

1．6 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計學分析采用SPSS 15．0軟件。治療前后均數(shù)比較采用配對樣本t檢驗:對正態(tài)分布指標用方差分析，并作兩兩比較;對非正態(tài)分布指標用非參數(shù)檢驗，多組間比較用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較用Mann-Whitney U檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 外周血干細胞采集和CD34+細胞分選結果

5例患者均1次動員成功，均采集2次。獲得單個核細胞數(shù)為(6．07 ±0．94)×108/kg，其中CD34+細胞數(shù)為(3．46 ±1．23)×106/kg。經(jīng)分選CD34+細胞數(shù)為(2．06 ±0．69)×106/kg，細胞純度為(82．10 ±6．03)%，回收率為(60．59 ±5．74)%。

2．2 造血和免疫重建情況

5例患者中性粒細胞計數(shù)達0．5×109/L以上中位時間10(8～12)d;血小板計數(shù)達20×109/L以上中位時間11(8～12)d。

所有患者移植前T淋巴細胞亞群分布與正常人群的分布接近。但移植后1個月T淋巴細胞、B細胞、NK細胞均較移植前下降(P＜0．01);移植后6個月上述指標升高(P＜0．01或 P＜0．05)，并在移植后12個月達到移植前水平。CD4+細胞移植后恢復速度及程度均較CD8+細胞顯著，詳見表1。

2．3 療 效

5例患者在行干細胞動員后肌力均有不同程度恢復，表現(xiàn)為吞咽困難、進食嗆咳和呼吸困難癥狀減輕，但是肌疲勞試驗仍陽性。

移植后1個月，4例患者無明顯肌無力癥狀出現(xiàn)，四肢肌力均達到V級，復查肌電圖明顯好轉，肌疲勞試驗為陰性。1例氣管切開患者于移植后3個月四肢肌力達到V級，肌疲勞試驗仍為陽性。4例乙酰膽堿受體抗體、胸腺瘤相關抗體陽性患者在移植后1個月抗體轉陰2例，另2例在移植后6個月抗體轉陰。所有患者在移植后3～6個月停用所有藥物治療。

全部患者均隨訪至2012年2月，中位隨訪時間44(24～84)個月，其中4例患者肌力正常，恢復正常生活、工作，脫離藥物治療，1例氣管切開患者移植后12個月因疾病復發(fā)而再次應用小劑量潑尼松、溴吡斯的明維持治療，目前MG癥狀控制良好，生活自理。5例患者移植后疾病狀況見表2。

2．4 不良反應

5例患者干細胞動員時無明顯不良反應發(fā)生，嘔吐、輕微骨痛2例，經(jīng)對癥處理后緩解。預處理后有發(fā)生ATG或ALG所致的血清病樣反應(包括高熱、皮疹、小關節(jié)疼痛)3例，加用甲潑尼龍或氫化考的松治療后緩解。移植前3例CMV抗原陽性患者予更昔洛韋治療后轉陰，移植后未發(fā)生CMV感染。移植后發(fā)生兩下肺輕度細菌感染2例，應用抗感染藥物后均有效控制。未發(fā)生肝靜脈閉塞病及出血性膀胱炎。

3 討論

異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)在理論上可完全或接近完全免疫重建，是治愈自身免疫病的理想方式，因此有的移植中心開始應用allo-HSCT治療難治性自身免疫病［3］。但是由于allo-HSCT后移植物抗宿主病等移植相關并發(fā)癥較高，限制了其在難治性自身免疫病中的推廣應用。Auto-HSCT的優(yōu)點在于無移植物抗宿主病發(fā)生的危險，移植相關病死率較低，患者生活質量較好，是目前治療難治性自身免疫病的主要移植技術，但缺點是疾病復發(fā)率較高［4］。因此，如何減少疾病復發(fā)，提高遠期療效是目前auto-HSCT治療難治性MG的難點。

表1 5例難治性重癥肌無力患者移植前后淋巴細胞亞群變化(ˉx±s)

表2 5例難治性重癥肌無力患者移植后疾病狀況

在難治性自身免疫病行auto-HSCT治療中，多數(shù)中心應用Cy(1．5～4 g/m2)聯(lián)合粒細胞集落刺激因子動員造血干細胞，也可單用粒細胞集落刺激因子動員。有相當一部分患者采用了CD34+細胞分選移植［5］。目前使用的預處理方案采用非清髓預處理方案，如單用白消安、單用 Cy(150 mg/kg或200 mg/kg)，聯(lián)合ATG，全身照射聯(lián)合化療，也有應用卡莫司汀、阿糖胞苷、白消安和依托泊苷聯(lián)合預處理［4］。FAC方案屬非清髓預處理方案，相對于清髓預處理方案具有預處理劑量低、毒副作用小，細胞植入速度快，多數(shù)患者能形成完全嵌合的特點，其目的在于使供受者之間產(chǎn)生雙向免疫耐受，適合于非腫瘤性疾病，年齡較大，有心、肝、腎、腦功能異常的患者。Auto-HSCT治療難治性MG的主要機制在于摧毀原有的免疫系統(tǒng)，通過自體干細胞輸注重建免疫并形成新的免疫耐受，不需要大劑量預處理方案清除腫瘤細胞，故非清髓方案更為適合。FAC方案可避免預處理骨髓抑制期較長帶來的致死性出血、感染危險，減輕藥物及全身照射對重要器官的損害。目前只有3個前瞻性隨機臨床試驗在驗證造血干細胞移植對自身免疫病的影響，方案分別采用Cy 200 mg/kg、ATG(兔)7．5 mg/kg，CD34+分選;Cy 120 mg/kg，ATG(equine)90 mg/kg，全 身 照 射 800 cGY，CD34+分選;Cy 200 mg/kg，ATG 7．5 mg/kg，未行CD34+分選［6］。目前尚未見完整的療效分析結果。

為了提高auto-HSCT對難治性MG的療效，我們嘗試應用純化的自體外周血CD34+細胞移植治療，經(jīng)分選得到 CD34+細胞數(shù)為(2．06±0．69)×106個/kg，細胞純度為(82．10 ±6．03)%。預處理方案則采用非清髓的Cy+氟達拉濱+ATG/ALG方案。目前已完成的5例難治性MG患者的移植過程均順利，一般在移植后30 d患者血象完全恢復正常，未出現(xiàn)相關嚴重并發(fā)癥。通過檢測自身免疫抗體、肌電圖等進一步評估病情，所有患者臨床癥狀緩解。目前中位隨訪時間已44(24～84)個月，其中4例患者肌力正常，恢復正常生活和工作，脫離藥物治療;1例氣管切開患者移植后12個月出現(xiàn)活動后肌無力癥狀，肌電圖有重頻刺激遞減現(xiàn)象，提示疾病復發(fā)。但是復查患者乙酰膽堿受體抗體和胸腺瘤相關抗體均為陰性，且移植前已經(jīng)行胸腺瘤切除術，復發(fā)可能與患者移植前病程已達22年有關。再次應用小劑量潑尼松(10 mg/d)、溴吡斯的明(60 mg/次，每天3～4次)維持治療后肌無力癥狀控制良好，目前生活自理。

值得注意的是，有資料顯示自身免疫病患者在auto-HSCT治療后有少部分出現(xiàn)了至少1個其他繼發(fā)性自身免疫病。多因素分析結果提示使用ATG和細胞分選移植是重要危險因素［7］，故這些患者仍需加強自身免疫病的隨訪以防止遠期并發(fā)癥的發(fā)生。

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