基于HIV基因組學(xué)研究中西藥合用治療艾滋病作用機制的探討和思考＊

李艷萍，溫 敏，趙 競，趙 遠(yuǎn)

（云南省中醫(yī)中藥研究院，云南 昆明650223）

艾滋病全稱為獲得性免疫缺陷綜合征（acquired i mmun m deficiency syndr o me，AIDS），該病由感染人免疫缺陷病毒（hu man i mmunodeficiency virus，HIV）而引起，導(dǎo)致被感染者免疫功能的部分或完全喪失，CD4細(xì)胞數(shù)量減少，功能降低，繼而發(fā)生多系統(tǒng)、多器官、多病原體的復(fù)合感染（機會性感染）和腫瘤等，臨床表現(xiàn)形式多種多樣。艾滋病至今無法治愈，嚴(yán)重危害人類的生命健康，如何防治艾滋病一直是世界關(guān)注的熱點，針對引起艾滋病的主要病毒——人免疫缺陷病毒（hu man i mmunodeficiency vir us，HIV）的干預(yù)、清除研究也是國內(nèi)外科學(xué)家探索治療艾滋病的策略方向。

1 HIV的病毒特征及性質(zhì)是其目前無法從人體完全清除的根本原因，病毒基因是決定其特征和性質(zhì)的關(guān)鍵，對HIV基因組序列分析，可反應(yīng)病毒遺傳變異調(diào)控信息，從而找到清除HIV的突破點。

HIV是一種逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒。HIV侵入人體后，在病毒逆轉(zhuǎn)錄酶、病毒體相關(guān)的DNA多聚酶的作用下，病毒RNA先反轉(zhuǎn)錄成c DNA（負(fù)鏈DNA），構(gòu)成RNA－DNA中間體。中間體中的RNA再經(jīng)RNA酶H水解，而以剩下的負(fù)鏈DNA拷貝成雙股DNA，逆轉(zhuǎn)錄過程線性DNA分子進入胞核并在病毒插入酶的催化下插入宿主DNA，成為細(xì)胞染色體的一部分。感染細(xì)胞后病毒的基因組序列可以通過逆轉(zhuǎn)錄整合到宿主的基因組當(dāng)中。當(dāng)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活，HIV的病毒基因也一起被轉(zhuǎn)錄。但由于HIV的病毒基因在選擇性壓力下存在高水平的遺傳變異性，其自身的逆轉(zhuǎn)錄酶忠實性差，同時在人體免疫應(yīng)答和抗病毒藥物的作用下病毒易出現(xiàn)突變和重組現(xiàn)象，形成變異－整合－轉(zhuǎn)錄－變異的循環(huán)鏈，故多年來艾滋病的防治及疫苗的研究并未取得突破性進展。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（HAART）是目前治療艾滋病的主流方法。醫(yī)學(xué)界曾一度寄希望于通過HAART治療徹底清除人體內(nèi)的HIV病毒，從而根治艾滋病。然而有許多證據(jù)表明，接受HAART并且血漿病毒水平已經(jīng)被抑制到檢出限以下的感染者體內(nèi)，仍然進行著低水平的病毒復(fù)制。

隨著基因工程研究的深入，部分臨床實驗室工作者和基礎(chǔ)科學(xué)研究人員開始注意到基因治療中的應(yīng)用潛力。國內(nèi)外的科學(xué)家們都試圖以HIV病毒基因遺傳變異調(diào)控的變化為目標(biāo)探索清除HIV的主要措施和策略。而基因治療的前提是我們要對艾滋病患者的基因組特征及病毒進化和傳播關(guān)系有充分的了解。一些研究人員通過基因片段及單位點的分析，解碼過艾滋病病毒基因組某一小部分的遺傳信息［1～5］，不同治療措施對HIV－1病毒某些基因片段或位點的作用也被研究過［6～12］。直至2009年8月美國科學(xué)家凱文·威克斯等［13］在NATURE雜志上發(fā)表了《HIV－1病毒RNA基因組的體系結(jié)構(gòu)和二次結(jié)構(gòu)》一文，HIV－1病毒的全基因組的編碼及結(jié)構(gòu)才被真正完全破解。由此，抗HIV的藥物及治療措施的研究目標(biāo)也由原來的單片段單位點轉(zhuǎn)移到了基因組序列。病毒基因組測序是了解病毒基因遺傳變異調(diào)控信息的最直接方法，能夠更真實反映病毒進化和傳播關(guān)系。

2 中醫(yī)藥、中西醫(yī)藥合用對艾滋病的療效已經(jīng)廣泛報道，我們也從病毒基因水平探討了中藥與HAART聯(lián)用治療，純HAART治療，純中藥治療對HIV－1病毒基因表達調(diào)控的影響作用，但以不同治療策略下群體HIV－1病毒基因組序列變化差異為目標(biāo)來研究作用機制的，國內(nèi)外未見報道。

我國治療艾滋病的策略主要有三種：中藥與HAART聯(lián)用治療，純HAART治療，純中藥治療。三種治療策略廣泛使用后的療效報道表明，純HAART治療可顯著抑制患者血漿中的HIV病毒量而發(fā)揮療效，但存在一定的毒副作用。純中藥治療在改善癥狀體征及提高免疫功能方面有明顯作用，延遲HIV－1感染者進入AIDS期［16］，但在抗病毒方面不能使體內(nèi)的HIV－RNA降低到檢測下限的水平。中藥與HAART聯(lián)用可互補而起到緩解毒副作用，增強免疫功能，減少存儲病毒釋放表達的效果，療效優(yōu)于純HAART、純中藥治療，國內(nèi)很多學(xué)者從免疫水平探討了三種治療策略對艾滋病患者免疫功能的影響進而闡釋不同治療機制。我們也從病毒基因水平探討了中藥與HAART聯(lián)用治療，純HAART治療，純中藥治療對HIV－1病毒基因調(diào)控表達的影響作用［17～20］。

從基因水平初步比較了中藥與HAART聯(lián)用治療、純HAART治療對HIV－1病毒基因表達的影響作用［17～19］，將127例患者隨機分為2組，分別為HAART＋安慰劑組（n＝62例），HAART＋康愛保生丸組（n＝65例），在治療前及治療后3，6，12月檢測所有患者全血中HIV－1中g(shù)ag，env、gag－pol基因的相對表達量，結(jié)果顯示：在HIV－1RNA有效抑制下，結(jié)果可見在第3個月治療HAART＋康愛保生丸組的HIV前病毒DNA的pol相對拷貝數(shù)和HAART＋安慰劑組有顯著性差異（P＜0.05），在12月治療過程中HAART＋康愛保生丸組的env、gag，pol基因的相對拷貝數(shù)基本都比HAART＋安慰劑組低。提示中西醫(yī)藥合用對HIV－1的env、gag，pol基因表達有一定影響作用。

從基因水平探索了純中藥治療是否對HIV－1病毒tat，rev，nef，vpr，vpu，vif的基因表達有所影響［20］，我們隨機抽取在本院艾滋病臨床研究室接受中醫(yī)藥治療的HIV感染者39例進行橫斷面調(diào)查。其中9例從未參與過任何治療的患者（空白組）；30例患者接受純中醫(yī)藥治療——21例治療時間小于12個月（短期治療組）；9例治療時間大于12個月（長期治療組）。39例患者均為本院收治的背景資料詳實，依從性較好的HIV感染者，在治療期間一直服用康愛保生丸。對39例艾滋病病毒感染者的HIV病毒tat，rev，nef，vpr，vpu，vif的蛋白表達量的測定及組間比較顯示，治療組rev、tat及vpr的蛋白表達量顯著低于空白組，（P＜0.05），治療長期組Tat的蛋白表達量顯著低于治療短期組（P＜0.05）。根據(jù)tat，rev，vpr三種蛋白的功能和作用，該三種蛋白表達的下調(diào)對HIV的復(fù)制，細(xì)胞毒性會產(chǎn)生一定的抑制作用。初步研究顯示，中醫(yī)藥可能對tat，rev，nef，vpr，vpu，vif具有一定的影響作用，提示中醫(yī)藥體內(nèi)抗HIV的作用機制可能是干預(yù)HIV病毒tat，rev，nef，vpr，vpu，vif的蛋白表達量，進而導(dǎo)致HIV病毒的復(fù)制能力及細(xì)胞毒性下降或缺失，患者能長期帶毒生存。

對于生物體來說，基因表達調(diào)控信息隱藏在基因序列的上游區(qū)域，在組成上具有一定的特征，可以通過序列分析識別這些特征，HIV病毒也不例外，已有研究顯示HIV病毒基因組序列的變化與基因表達、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、調(diào)控密切相關(guān)，進而影響疾病進程。通過單位點片段基因多態(tài)性分析純HAART治療下病毒的耐藥變異研究顯示：HIV病毒基因呈高突變以抵抗抗病毒治療的藥物壓力，已經(jīng)確定的與6類艾滋病抗病毒藥物耐藥的有關(guān)HIV基因突變有200多個，其中50多個逆轉(zhuǎn)錄酶（Reversetranscriptase，RT）基因的突變與核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（Nucleosid reverse transcriptase inhibitor，NRTIs）的耐藥有關(guān)，包括M184 V、TA Ms、非核苷類似物的耐藥相關(guān)突變，多核苷耐藥性突變以及一些附屬突變；40多個RT基因的突變與非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（Non－nucleoside reverse tran－scriptase inhibitor，NNRTIs）的耐藥有關(guān)，包括主要的原發(fā)和繼發(fā)突變，非多態(tài)性次要突變以及多態(tài)性附屬突變；60多個突變與蛋白酶抑制劑（Protease inhibitor，PIs）的耐藥有關(guān)，耐藥變異對病毒的生物學(xué)特性產(chǎn)生了不同程度的影響［21～35］。通過全基因組序列分析HIV病毒在選擇性壓力下的變異情況的研究也有相關(guān)報告［36～39］。但這些位點或序列的變異研究僅處于橫斷面，未對病毒基因組進行不同時間點變化情況的分析研究。而中藥聯(lián)用HAART治療、純中藥治療下，HIV－1病毒基因組變異情況；以不同治療策略下群體HIV－1病毒基因組序列變化差異為目標(biāo)來研究作用機制的，國內(nèi)外未見報道。

3 通過研究中醫(yī)藥、中西醫(yī)藥合用治療時，HIV病毒基因組序列的變異規(guī)律，探索多位點變異和治療方法的內(nèi)在聯(lián)系，對從病毒基因水平闡釋不同治療策略的抗HIV作用機制有重要意義，在分析HIV－1基因的致病能力、分子流行病學(xué)和開發(fā)靶向抗病毒藥物及疫苗具有積極的應(yīng)用前景。

目前，由于尚無大樣本HIV－RNA病毒基因組變化的基礎(chǔ)信息，人們對HIV－1的基因變異規(guī)律及其與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的過程缺乏相對完整認(rèn)識，不能全面揭示HIV－1全基因組遺傳變異與疾病進展的內(nèi)在聯(lián)系。己有的研究大多數(shù)是探討HIV－1基因中某一部分的變異情況與病情演變的關(guān)系，并沒有對不同群體樣本基因組序列變化情況進行研究。雖然歐美國家對于其流行的毒株己有了一定的研究，但目前在國際HIV序列數(shù)據(jù)庫收錄的1800條HIV病毒近基因組序列中，只有46條是來自中國，同時，獲得病毒基因全序列的技術(shù)方法也有待改進，因此如何確保得到的全長基因完整性成為現(xiàn)今急需解決的問題。

通過研究不同治療策略下，HIV病毒基因組序列的變異規(guī)律，構(gòu)建大樣本HIV－1基因組序列數(shù)據(jù)庫，可在HIV－1病毒組學(xué)方面獲得以下重要信息：

基因組學(xué)方面，可對同月份不同治療策略所取樣本進行基因組與HIV Database做比對，發(fā)現(xiàn)snp，indel位點，水平基因轉(zhuǎn)移的發(fā)生，并進一步研究這些位點的變化，對病毒致病性，耐藥性的影響；對所有病毒的基因組進行core and pan geno me分析，發(fā)現(xiàn)HIV病毒的保守基因，作為藥物治療研究的潛在基因靶位點；對所有月份病毒基因組與HIV Database做比對，使用treebest軟件進行系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建，并進行Ka／ks分析，對HIV病毒的系統(tǒng)發(fā)育及不同選擇壓力下變異的情況進行研究。RNA病毒變異很大，在同個樣品中存在類似“種群”的多種亞型，通過高深度測序，測得盡可能全面的亞型后，分析在不用樣品中各種不同“亞型”的分布比例。通過生物信息學(xué)方法的比較，獲得每個樣品中種群變化的信息，全面關(guān)聯(lián)藥物使用讓HIV的變化，包括主要“亞型”的變化，“亞型”組成的變化等，分析藥物對HIV可能作用的位點，并探索在不同選擇壓力下，HIV進化、變異的區(qū)別。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)方面，可對相同月份，不同的治療策略下的病毒樣品進行轉(zhuǎn)錄組研究，發(fā)現(xiàn)致病性較強的病毒與致病性較弱的病毒基因表達的差異，結(jié)合患者及病毒的特點，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致致病性減弱的原因，并作為治療HIV病毒侵染的可能手段。

基于以上的結(jié)果分析，可發(fā)現(xiàn)HIV－1感染者接受不同干預(yù)措施后HIV－1基因組序列差異，初步分析多位點變異和治療方法的內(nèi)在聯(lián)系，我們可從病毒基因水平闡釋不同治療策略的抗HIV作用機制，探索抗HIV病毒新的和可能的靶點，為中西醫(yī)結(jié)合治療艾滋病提供臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)支持，為我國HIV－1感染的預(yù)防、診斷、監(jiān)測和治療提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，在分析HIV－1基因的致病能力、分子流行病學(xué)和開發(fā)靶向抗病毒藥物及疫苗具有重要的應(yīng)用前景。

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