臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞來源的微囊泡促進(jìn)腹膜樣組織血管化的初步研究

程中良 鄒翔宇 吳帥 琚官群 朱英堅(jiān)

組織血管化是臨床成功應(yīng)用組織工程技術(shù)進(jìn)行組織修復(fù)的重要條件之一。如果沒有快速高水平的組織血管化，移植物中的種子細(xì)胞在移植早期不易存活[1]。目前組織血管化的策略主要包括以下幾種：①對支架材料的表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾[2-3]；②在材料內(nèi)復(fù)合緩釋的生長因子[4-6]；③對種子細(xì)胞進(jìn)行基因修飾[7-8]。雖然這些方法在促進(jìn)新生血管生成方面具有一定的作用和價(jià)值，但是存在支架材料的制備工藝復(fù)雜、生長因子降解速度快，以及進(jìn)行基因修飾的種子細(xì)胞存活率低等缺點(diǎn)。研究能夠促進(jìn)組織血管化的簡單方法是組織工程領(lǐng)域重要研究課題之一[9]。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，腹膜間皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞構(gòu)建的組織工程腹膜樣組織，可用于尿道缺損的替代修復(fù)[10-11]。但是一旦尿道缺損面積太大，滋養(yǎng)血管不能充分供給中心區(qū)域時(shí)，就會導(dǎo)致治療失敗。

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）是能夠促進(jìn)組織工程組織血管化的一種重要的生長因子。已有文獻(xiàn)證實(shí)，腹膜間皮細(xì)胞在一定條件下也可分泌VEGF[12]。因此，如能尋找到一種促進(jìn)腹膜間皮細(xì)胞分泌VEGF增多并進(jìn)一步促進(jìn)腹膜樣組織血管化的方法，就可能明顯提高腹膜樣組織進(jìn)行組織工程替代的療效。

近年來，越來越多的研究聚焦于細(xì)胞的微囊泡。微囊泡被認(rèn)為是細(xì)胞間信號傳遞的重要分子，在細(xì)胞通訊和細(xì)胞相互作用中具有重要作用。微囊泡是各類細(xì)胞遭受一系列應(yīng)激（激活或凋亡）時(shí)，從細(xì)胞質(zhì)膜上脫落而釋放的膜性小囊泡[13]。已有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞來源的微囊泡能夠刺激多種細(xì)胞增殖和抑制凋亡[14-15]，并能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞自分泌VEGF[16]和啟動(dòng)血管生成。本研究旨在探討人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞來源的微囊泡能否促進(jìn)大鼠腹膜間皮細(xì)胞增殖，刺激其分泌VEGF，并促進(jìn)體內(nèi)腹膜樣組織血管化，為組織工程腹膜樣組織的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

SD大鼠、裸鼠（上海第九人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），新生嬰兒廢棄臍帶（上海市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科無償獲得，均經(jīng)產(chǎn)婦知情同意），DMEM培養(yǎng)基、EGM-2培養(yǎng)基（Lonze公司），胎牛血清（HyClone公司）， 胰蛋白酶（Sigma 公司），CD31、VE-Cad 因子（Abcan 公司），Vimentin、CK-AE1/AE3（Santa Cruz公司），兔抗小鼠二抗（Dako公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記的熒光二抗（Dako公司），人VEGF的ELISA試劑盒、大鼠VEGF的試劑盒（R﹠D公司），Ⅰ型膠原酶（Gibco公司），小腸粘膜下層（SIS）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠腹膜間皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

取4周齡SD雄性大鼠4只，肌肉注射10%水合氯醛0.5～0.8 mL麻醉，向大鼠腹腔內(nèi)注射0.25%胰蛋白酶20～30 mL和0.02%EDTA消化液。1 h后脫頸處死大鼠，75%乙醇全身浸泡消毒10min。將大鼠仰面置于超凈工作臺，沿腹白線依次剪開腹壁皮膚及肌肉，吸出腹腔內(nèi)的消化液，移入15 mL離心管中，加入含20%FBS血清培養(yǎng)基中和胰酶，1500 r/min離心15min，棄上清液，加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液，輕輕用吹打成細(xì)胞混懸液，分裝于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)基，使總體積達(dá)到4～5 mL，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d更換1次完全培養(yǎng)基。常規(guī)傳代，取第2代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和鑒定。

1.2.2 hUVECs原代培養(yǎng)

取胎兒臍帶10～30 cm，PBS沖洗，分離臍帶組織中管腔大、管壁薄的臍靜脈，在臍靜脈一端插入鈍頭灌流玻璃管并固定，PBS沖洗臍靜脈腔，直至流出液澄清無血色；夾閉臍靜脈另一端，臍靜脈內(nèi)灌注0.1%Ⅰ型膠原酶使其充盈，37℃消化10～12min，收集消化液至50 mL離心管中，并用EGM-2培養(yǎng)液沖洗靜脈，將收集液以1500 r/min離心5min，小心棄上清液，以EGM-2培養(yǎng)液將細(xì)胞沉淀重新懸浮，調(diào)整細(xì)胞密度為（2～3）×105cells/mL，轉(zhuǎn)移至 25 cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24h后觀察細(xì)胞貼壁及生長情況并更換培養(yǎng)液，之后每2天半量換液1次。取第3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)以及鑒定。

1.2.3 hUVECs來源的微囊泡分離、定量和投射電鏡掃描鑒定

hUVECs培養(yǎng)至80%融合時(shí)，棄培養(yǎng)液更換為含0.25%BSA的無血清EGM-2，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集上清液，2000 g離心20min，以去除細(xì)胞碎片，收集上清放入超高速真空離心機(jī)以100000 g、4℃離心1 h，棄上清加入無血清M199洗滌后，再次行超高速真空離心。棄上清，再于2.5%戊二醛溶液固定，4 ℃、2 h以上，PBS（pH7.2）沖洗，1%鋨酸固定后，乙醇梯度脫水，100%丙酮浸透，環(huán)氧樹脂包埋、切片，將切片鋪于銅網(wǎng)上，經(jīng)枸櫞酸鉛及醋酸雙氧鈾染色后，透射電鏡觀察并照相。余微囊泡的重懸于M199培養(yǎng)基中，微囊泡中所含蛋白質(zhì)用BAD法行蛋白定量，放入-80℃冰箱保存。

1.2.4 微囊泡對rPMC增殖的影響

取對數(shù)生長期的rPMC重懸成1×105cells/mL，每孔取100μL種植在96孔板中，待細(xì)胞貼壁后試驗(yàn)組每孔加入30 μg/mL含hUVECs來源微囊泡的蛋白，對照組不加，每組細(xì)胞6個(gè)副孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育， 分別培養(yǎng) 0、24、48、72 h 后，棄上清，每孔加入CCK-8試劑10μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，用酶標(biāo)儀進(jìn)行450 nm處吸光度值的測量。

1.2.5 RT-PCR檢測微囊泡組和對照組rPMC

rPMC以5000個(gè)/孔種植在6孔板中，貼壁后MVs組加入30 μg/mL微囊泡，對照組不加，分別在24、48、72 h收集上清液，按ELISA試劑盒說明分別檢測大鼠和人來源VEGF濃度。棄上清后，貼壁細(xì)胞采用TRIzol一步法提取總RNA，2 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系20μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列包括人VEGF上游引物5'-cccactgaggagtccaacat-3'， 下游引物 5'-aaatgctttctccgctctga-3'，大鼠 VEGF上游引物5'-gcccatgaagtggtgaagtt-3'，下游引物5'-tatgtgctggctttggtgag-3'，以β-actin為內(nèi)參照，擴(kuò)增后 1.8%瓊脂糖凝膠電泳（90 V，30min）進(jìn)行PCR產(chǎn)物鑒定，電泳圖像分析儀掃描分析。

1.2.6 rPMC種植在SIS表面移植裸鼠皮下

收集第2代腹膜間皮細(xì)胞，以2×106cells/cm2細(xì)胞密度，將rPMC均勻接種至小腸黏膜下層（Small intestine submucosa，SIS）支架（第九人民醫(yī)院組織工程實(shí)驗(yàn)室提供）表面，實(shí)驗(yàn)組放入含hUVECs來源的微囊泡30 μg/mL的DMEM培養(yǎng)液，對照組為單純DMEM培養(yǎng)液，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中，隔天換液，1周后分別接種于4周齡裸鼠側(cè)背部皮下。2周后取出支架移植物，經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，脫蠟、脫水、HE染色，鏡下觀察拍照，并對微血管樣結(jié)構(gòu)計(jì)數(shù)（光學(xué)顯微鏡下，10×20倍視野下，每張片隨機(jī)選取不重疊的5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)）。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rPMC和hUVECs鑒定

剛消化下來的腹膜間皮細(xì)胞在光鏡下呈分散的小圓型細(xì)胞，約24h左右貼壁；融合前相差顯微鏡觀察，細(xì)胞呈多樣形（梭形、橢圓形、多角形等）。體外培養(yǎng)1周，細(xì)胞生長融合，倒置相差顯微鏡觀察，細(xì)胞呈多角形，大小一致，“鋪路石樣”外觀（圖1a）。細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色顯示，抗細(xì)胞角蛋白抗原（CKAE1/AE3）和抗波形蛋白抗原（Vimentin）陽性（圖1b、C）。hUVECs原代培養(yǎng)后，相差顯微鏡下可見細(xì)胞單層排列，邊界清楚，呈圓形、短梭形或扁平形，3～4 d融合成單層，鋪路石樣排列（圖1d）。細(xì)胞免疫熒光示CD31和VE-Cad陽性表達(dá)（圖1e、f）。

2.2 透射電鏡觀察微囊泡

透射電鏡下可見有完整膜結(jié)構(gòu)的微囊泡(圖2）。

2.3 微囊泡對腹膜間皮細(xì)胞增值的影響

微囊泡組在 24、48、72、96 h 與對照組相比，增殖效應(yīng)明顯增強(qiáng)（P<0.05）（圖 3）。

2.4 腹膜間皮細(xì)胞上清液VEGF蛋白質(zhì)水平

培養(yǎng)的rPMC經(jīng)微囊泡干預(yù)后與對照組相比，在24、48、72 h分別采取ELISA方法對細(xì)胞培養(yǎng)上清液行大鼠VEGF檢測，發(fā)現(xiàn)加入hUVECs來源的微囊泡組上清液中，大鼠來源VEGF含量與對照組相比顯著升高（P<0.05）（圖4），未檢測到人來源VEGF表達(dá)。

2.5 腹膜間皮細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)

培養(yǎng)的rPMC經(jīng)hUVECs來源的微囊泡干預(yù)后與對照組相比，大鼠VEGF的mRNA行RT-PCR檢測，在 24、48、72 h 的表達(dá)均明顯高于對照組（圖 5）。兩組均未檢測到人來源的VEGF的mRNA表達(dá)。

2.6 微囊泡對SIS支架內(nèi)新生微血管樣結(jié)構(gòu)的影響

被覆rPMC的SIS支架移植入裸鼠皮下2周后，HE染色可見MVs組移植物中含大量紅細(xì)胞的新生微血管樣結(jié)構(gòu)。加入hUVECs來源的微囊泡組中新生血管密度較對照組顯著增多（P<0.05）（圖6）。

圖1 腹膜間皮細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和鑒定Fig.1 The morphological features and identifications of peritoneal mesothelial cells and human umbilical vein endothelial cells

圖2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞來源的微囊泡透射電鏡觀察（80 KV，30000×）Fig.2 The TEM observations of microvesicles(MVs)derived from human umbilical vein endothelial cells(80 KV,30000×)

圖3 微囊泡對腹膜間皮細(xì)胞增殖的影響Fig.3 The effects of MVs on growth ability of rat peritoneal mesothelial cells

圖4 ELISA檢測24、48、72 h上清液中大鼠VEGF的表達(dá)（*：P<0.05）Fig.4 The rat VEGF expression of supernatant in MVs group and control group at 24,48,72 h were tested by ELISA(*:P<0.05)

圖5 RT-PCR檢測MVs組和對照組大鼠VEGF表達(dá)Fig.5 The rat VEGF expression in MVs group and control group were tested by RT-PCR

圖6 移植裸鼠皮下及取出后HE染色觀察微血管樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量Fig.6 Transplanted subcutaneously into nude mice,and the number of microvessel-like structures by HE staining

3 討論

先天或后天原因所導(dǎo)致的尿道狹窄和缺損，尤其是大于2 cm的長段尿道缺損和復(fù)雜性尿道狹窄的尿道重建，仍然是困擾泌尿外科的難題之一。組織工程學(xué)為此提供了全新的思路。在尿道組織工程中，種子細(xì)胞的選擇仍然是研究熱點(diǎn)。自體尿路移行上皮細(xì)胞是理想的種子細(xì)胞來源。但是，尿路上皮細(xì)胞的來源有限，體外培養(yǎng)和擴(kuò)增較為困難。腹膜間皮細(xì)胞來源于中胚層，同時(shí)表達(dá)間葉細(xì)胞和上皮細(xì)胞的分子標(biāo)記，易在體外培養(yǎng)和擴(kuò)增。同時(shí)，大網(wǎng)膜和腹膜表面覆蓋間皮細(xì)胞，因此具有量多、易取的特點(diǎn)。應(yīng)用腹膜間皮細(xì)胞覆蓋的自體管狀組織修復(fù)尿道缺損研究取得了良好的效果[10]。同時(shí)，應(yīng)用腹膜間皮細(xì)胞作為尿道組織工程的種子細(xì)胞進(jìn)行尿道修復(fù)，也取得了預(yù)期的效果[11]。目前的研究中，面臨的瓶頸就是工程化組織的血管化問題。

近年來，血管化問題的研究取得了一些進(jìn)展，但仍未達(dá)到理想的效果。微囊泡，作為一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞間信號傳遞分子，可能在促進(jìn)細(xì)胞自分泌生長因子以及促進(jìn)血管化方面具有一定的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，微囊泡與靶細(xì)胞之間的作用方式主要表現(xiàn)為以下幾種：①通過其表面的配體與靶細(xì)胞的受體結(jié)合繼而激活或者抑制靶細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[17]。②傳遞母細(xì)胞的蛋白質(zhì)或mRNA到靶細(xì)胞[18]。微囊泡在形成過程中可以將母細(xì)胞質(zhì)中的成分（蛋白質(zhì)、mRNA或miRNA包裹進(jìn)去），然后傳遞到靶細(xì)胞中，使其具有新的生物學(xué)或遺傳特征。③將母細(xì)胞膜的受體轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞而呈現(xiàn)相關(guān)受體表型[16]。④作為載體轉(zhuǎn)移完整的細(xì)胞器或者致病因子[19]。最新研究顯示,內(nèi)皮細(xì)胞來源的微囊泡被證實(shí)能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并抑制凋亡，同時(shí)能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞自分泌VEGF，并啟動(dòng)血管生成。本實(shí)驗(yàn)中，我們成功地從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的上清液中分離出微囊泡，并初步證實(shí)此微囊泡能夠促進(jìn)腹膜間皮細(xì)胞增殖、刺激其釋放VEGF，并使移植的組織工程樣腹膜組織血管化。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞來源的微囊泡與大鼠的腹膜間皮細(xì)胞共培養(yǎng)后，上清液中的大鼠來源的VEGF表達(dá)增高，但未檢測出人VEGF蛋白表達(dá)，也沒有檢測到人VEGF的mRNA表達(dá)。據(jù)此，我們推測，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞來源的微囊泡可能是通過其表面的配體與靶細(xì)胞的受體結(jié)合，繼而激活或者抑制靶細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而激活腹膜間皮細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)VEGF高表達(dá)的信號通路，具體的機(jī)制尚需更進(jìn)一步的研究。

本實(shí)驗(yàn)中，我們首次證實(shí)了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞來源的微囊泡在體外能促進(jìn)大鼠腹膜間皮細(xì)胞增殖，同時(shí)刺激大鼠來源的VEGF釋放。同時(shí)，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)微囊泡可促進(jìn)組織工程化腹膜樣組織血管化增加，該發(fā)現(xiàn)為組織工程組織血管化研究提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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