電針“百會”、“風府”和“陽陵泉”對帕金森病模型大鼠氧化應激反應的影響*

郭春霞，張曉雷，邵水金△，郝 莉，朱 晶

(1.上海中醫(yī)藥大學，上海 201203;2海綠谷制藥有限公司，上海 201203)

帕金森病 (Parkinson’s disease，PD)又稱震顫麻痹，是一種多發(fā)于中老年人的常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床以靜止性震顫、運動遲緩等為主要特征，尚有語言減少和聲音低沉單調、吞咽困難、流涎、睡眠障礙、抑郁或癡呆等癥狀，嚴重影響患者的運動能力和生活質量。由于PD的病因尚未完全明確，于是提出各種假說，如遺傳因素學說、氧化應激學說、環(huán)境因素學說、細胞凋亡學說等。而氧化應激學說在PD的發(fā)病中仍占主導地位［1－3］。此外，由于 PD是一種慢性進展性疾病，目前尚無根治的方法，治療以左旋多巴等藥物為主，但只能緩解臨床癥狀，且療效遞減性以及副作用 (抑郁、焦慮、幻覺、欣快、精神錯亂、輕度躁狂等)一直是困擾人們的難題。近年來，針灸以其自身優(yōu)勢，在改善PD的運動障礙、延緩PD進程、減少左旋多巴的毒副作用、提高患者的生活質量等方面已發(fā)揮了重要作用，逐漸受到人們的重視，針灸因此成為治療帕金森病的方法之一［4］。本研究通過觀察電針“百會”、“風府”和“陽陵泉”對帕金森病模型大鼠氧化應激反應的影響，探討電針對帕金森病可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠60只，體重180～220g，由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號:SYXK(滬)2004－2005。

1.2 藥物、試劑和儀器

藥物及試劑:美多芭 (上海羅氏制藥公司，批號SH11687)，6－羥基多巴胺 (美國 Sigma公司，批號048k3728)、阿撲嗎啡 (美國 Sigma公司，批號100839－200601)、抗壞血酸 (美國Sigma公司，批號063k1082)，慶大霉素 (上海第一制藥廠)，丙二醛 (MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)、谷胱甘肽 (GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒 (南京建成生物工程研究所)，戊巴比妥鈉 (上海中西藥業(yè)股份有限公司，批號WS20090920)，冰醋酸 (國藥集團化學試劑有限公司)，等。

儀器:TOW－3A型大鼠腦立體定位儀 (廣東汕頭市教育醫(yī)學儀器廠)，XW－80A型旋渦混合器 (上海醫(yī)科大學儀器廠)，UV754N型紫外分光光度計 (上海精密科學儀器有限公司)，華佗牌針灸針 (蘇州醫(yī)療用品廠)，KWD－808型全能脈沖電療儀 (上海電子儀器廠)等。

1.3 PD模型制備方法

采用經(jīng)典的PD模型［5］。術前按常規(guī)進行行為測試，確認無異常旋轉行為后，用戊巴比妥鈉(3%的戊巴比妥鈉，50mg/kg)腹腔注射麻醉。然后將大鼠固定于腦立體定位儀上，頭部去毛，苯扎溴銨常規(guī)消毒。無菌條件下，沿正中線切開大鼠顱頂皮膚，剝離骨膜，暴露前囟。以前囟為準，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜［6］，確定右側黑質二坐標:①前囟后5.2mm，正中線右側1.0mm，硬膜下9.0mm。②前囟后5.2mm，正中線右側2.5mm，硬膜下8.5mm。用顱骨鉆于手術要求部位小心鉆開顱骨，用5μL微量進樣器將6－OHDA(溶于含0.02%抗壞血酸的生理鹽水中，即秤量藥品抗壞血酸0.001g，溶于生理鹽水0.5mL中)注入右側黑質部 (以1.0 mm/min速度緩慢進針)，每孔3μL，注射速度為1μL/min，注射完畢后留針5min，然后以1.0 mm/min速度緩慢退針。手術完成后，用醫(yī)用明膠海綿填塞顱骨孔，縫合切口皮膚，肌肉注射慶大霉素7d，待動物清醒后放回飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)。正常對照組只固定大鼠，不進行任何處理。

10d后，以腹腔注射APO 0.5mg/kg誘發(fā)大鼠向一側旋轉，記錄從開始旋轉至30min內的旋轉圈數(shù)，以旋轉圈數(shù)平均＞7次/min者為合格的PD模型［7］。

1.4 分組及治療

將成功PD模型大鼠 (31只)隨機分為4組:①電針組9只:采用類比法取穴，腧穴定位如下:風府:在大鼠頭項部，枕外隆凸直下凹陷處;百會:在大鼠頭頂部，兩耳尖連線的中點處;陽陵泉:在大鼠小腿外側，膝關節(jié)下外1.5cm處。用0.25×13mm的針灸針，刺0.6～1cm深，稍行提插捻轉手法。使用全能脈沖電療儀，正、負電極輸出線分別夾在“百會”、 “風府”和雙側“陽陵泉”穴位上的毫針針柄上。選用斷續(xù)波型，電針頻率為5hz，電流強度為20mA左右，以肌肉出現(xiàn)輕微抽動為準。每次刺激時間為15min，每日1次，每周6次，共治療4周。②美多芭組8只:灌胃給藥，劑量135mg/kg(10mL/kg)，每日1次，每周6次，共給藥4周。③電針結合美多芭組8只:方法如電針組治療結合美多芭組治療，每日1次，每周6次，共治療4周。④模型組6只:不做任何處理。正常對照組6只也不做任何處理。各組除干預措施不同外，其余各條件一律相同。

1.5 標本采集

治療結束后，立即斷頭取腦，小心分離黑質，制備腦黑質勻漿液。操作方法:取腦黑質，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，放入10 mL的勻漿管內;在勻漿管中加冷的0.86%鹽水0.65mL，用眼科剪盡快剪碎腦黑質塊;再加入冷的0.86%生理鹽水0.3mL進行充分勻漿。將勻漿液以4000r/min離心15min，將上清液置－20℃冰箱中備用［8］。

1.6 檢測指標及方法

氧自由基檢測方法:取適量上清液進行MDA，GSH，GSH－Px和SOD的檢測，具體方法按南京建成生物工程研究所試劑盒說明書步驟進行測試。

1.7 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)用 (mean±s)表示，兩組間各參數(shù)比較采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，t檢驗方法進行統(tǒng)計學分析，其中P＜0.05說明兩組之間差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01說明兩組之間差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

動物造模成功率57.41%.與正常對照組比較，模型組SOD活性降低，MDA含量升高，GSH含量降低，GSH－PX活性降低，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。與模型組比較，電針組、美多芭組、電針+美多芭組均能提高SOD、GSH－Px活性，提高GSH含量和降低MDA含量，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。而美多芭組，電針組和電針+美多芭組黑質中SOD、MDA、GSH和GSH－Px含量測定結果比較，差異均無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)。(見表1)

3 討論

《資生經(jīng)》曰: “百會”又名天滿，屬督脈，為督脈與足太陽、手足少陽和足厥陰五條經(jīng)脈之所會，故有“三陽五會”之稱， 《針灸大成》中稱“主心煩悶，驚悸健忘，忘前失后，心神恍惚”，具開竅醒神之功，針刺“百會”可以激發(fā)頭部和諸經(jīng)經(jīng)氣，治療腦病和十四經(jīng)病，調一身之陰陽氣血，補腦益髓。風府穴出自《素問》，“頭重，身痛，惡寒，治在風府”，《備急千金要方》風府主治“舌緩，不能言”，這些臨床癥狀似屬于帕金森病癥狀范疇;針刺風府穴可以振奮督脈陽氣，宣散風邪，調理氣血，使經(jīng)脈氣血疏通，臨床帕金森病治療有較多應用。陽陵泉穴始出自《靈樞·邪氣臟腑病形》篇，是足少陽膽經(jīng)合穴，又是八會穴之一的“筋會”，位于小腿外側當腓骨頭前下方凹陷處，是臨床的常用穴;具有強健腰膝、通絡止痛等功效;近年來，陽陵泉穴單穴或處方配穴應用治療多種疾病，如肩周炎、膝關節(jié)炎、面肌痙攣、偏癱、坐骨神經(jīng)痛、扭挫傷等病證;臨床研究認為針刺陽陵泉，對調整腦血流量有一定影響，對急性缺血性中風患者，通過針刺治療取得良好療效［9］?；谏鲜鲈蚣捌渑R床在治療帕金森病的應用，本實驗針對性的選擇“百會”、 “風府”和“陽陵泉”三穴，并考察電針該三穴位對帕金森病模型大鼠氧化應激反應的影響，探討電針對帕金森病可能的作用機制。

本實驗結果表明，模型組與正常對照組比較，SOD活性降低，MDA含量升高，GSH含量降低，GSH－PX活性降低，提示帕金森病大鼠的氧化反應被激活，處于氧化應激狀態(tài);同時說明機體清除氧自由基的能力低，細胞膜結構和功能的完整性受損，機體細胞受自由基攻擊的程度加重。與模型組比較，美多芭組、電針組、電針結合美多芭組均能提高SOD活性，提高GSH－Px活性，提高GSH含量和降低MDA含量，說明三種治療方法均能使機體清除氧自由基的能力提高，機體細胞受自由基攻擊的程度減輕，對細胞膜結構和功能的完整性起到保護的作用。而美多芭組，電針組和電針結合美多芭組組間測定結果比較，差異多無統(tǒng)計學意義，說明此三種治療方法誰更略勝一籌，尚無定論。通過本實驗可以推測，電針治療清除過氧化脂質及自由基，提高機體抗氧化能力的作用機制，可能與其對機體的多方面調節(jié)作用有關，電針通過局部治療與整體調節(jié)作用，達到了對自由基的清除作用，從而使機體免受自由基的損害。

［1］Di Monte DA.The environment and Parkinson's disease:is the nigrostriatal system preferentially targeted by neurotoxins［J］.Lancet Neurol，2003(2):531－538.

［2］Vila M，Przedborski S.Genetic clues to the pathogenesis of Parkinson's disease［J］.Nat Med，2004(10 suppl):S58－S62.

［3］Jenner P.Oxidative stress in Parkinson S disease ［J］.Ann Neurol，2003，53(suppl 3):S26 －S38.

［4］賈軍，李博，孫作厘，等.電針防治帕金森病的實驗研究.科技導報 ［J］，2007，25(23):74－80.

［5］Ungerstedt U，Arbthnott GW.Quantitative recording of rotational behavior in rats after 6－OHDA lesions the nigrostriatal dopamine system ［J］.Brian Res，1970，24:485－493.

［6］包新民，舒思.大鼠腦立體定位圖譜［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1991:53.

［7］Carman LS，Gage GH，Shuhs CW.Partail lesion of the substantia nigra:relation.between extent of lesion and rotational behavior［J］.Brian Res.1991，553:275 －83.

［8］何建成，袁燦興.6－羥基多巴胺帕金森病模型大鼠氧化應激反應［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2007，25(11):4920－4922.

［9］賈玉勤，張倫忠，馮樂燕，等.帕金森病的中醫(yī)藥治療概況 ［J］.中國中醫(yī)藥科技，2010，15(2):183－184.