Toll樣受體及其與牙周疾病的關(guān)系

魏玲玲，侯 萌，王 萍 綜述;宋 暉 審校

(山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院初診科，山東濟(jì)南250000)

固有免疫系統(tǒng)在機(jī)體防御中具有重要意義，可視為宿主抵御致病微生物的第一道防線。固有免疫系統(tǒng)一方面可以通過急性炎癥反應(yīng)等直接清除感染;另一方面還可誘導(dǎo)獲得性免疫系統(tǒng)的活化，進(jìn)而激發(fā)更加高效和特異性的免疫反應(yīng)。固有免疫系統(tǒng)依靠模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)來識(shí)別細(xì)菌、病毒等外來微生物。Toll樣受體 (Toll like receptors，TLRs)是固有免疫系統(tǒng)中的病原模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors，PRR)，能識(shí)別大量微生物表面的高度保守結(jié)構(gòu)并通過細(xì)胞間信號(hào)通路活化固有免疫細(xì)胞，從而激發(fā)獲得性免疫應(yīng)答［1］。牙齦上皮細(xì)胞持續(xù)地暴露于至少500種口腔共生菌和致病菌中［2］，牙周組織為口腔微生物與免疫系統(tǒng)的持續(xù)性接觸提供了獨(dú)特的環(huán)境。牙周炎是一種慢性細(xì)菌感染性疾病，是由菌斑刺激導(dǎo)致的宿主免疫炎性反應(yīng)從而引起的牙周支持組織破壞。這就提示TLR可能在牙周生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用，本文就其與牙周病的相關(guān)性研究作一綜述。

1 TLR及其信號(hào)通路

1.1 TLRs及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

TLRs是一類廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的生物模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別大量微生物表面的高度保守結(jié)構(gòu)，如細(xì)菌脂多糖、肽聚糖、脂蛋白、細(xì)菌DNA、雙鏈RNA等，這些結(jié)構(gòu)被稱作病原體相關(guān)分子模式 (pathogen associated molecular pattern，PAMP)。Anderson KV等(1985)首次發(fā)現(xiàn)了Toll基因產(chǎn)物即跨膜蛋白Toll蛋白，并認(rèn)為其在果蠅胚胎背腹側(cè)的發(fā)育中起關(guān)鍵作用，且能調(diào)節(jié)果蠅因真菌感染所致的免疫反應(yīng)［3］。由于與果蠅Toll的同源性，后將哺乳動(dòng)物的該蛋白稱作Toll-like受體(Toll-like recepters，TLRs)［4］。迄今為止，共發(fā)現(xiàn)10種人類跨膜蛋白基因?qū)儆赥LR家族。

TLRs具有高度保守的結(jié)構(gòu)域特征，屬Ⅰ型跨膜受體，由細(xì)胞外區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)3個(gè)功能區(qū)組成。其胞外區(qū)含有19～25個(gè)亮氨酸重復(fù)序列，是配體結(jié)合的特異部位，主要功能是促進(jìn)蛋白質(zhì)間的相互粘附。人類所知10種TLRs的胞外富含亮氨酸的重復(fù)基序能針對(duì)標(biāo)識(shí)不同微生物感染的特異性PAPM發(fā)生反應(yīng)。該相對(duì)限制部位決定了其識(shí)別PAPM的專一性，但某些特定的PAPM通常需要多個(gè)TLR聯(lián)合識(shí)別。例如:TLR4主要介導(dǎo)G-菌的內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo);TLR5能夠識(shí)別細(xì)菌的鞭毛蛋白;而TLR2可與TLR1或TLR6形成異源二聚體，識(shí)別多種病原結(jié)構(gòu)，包括細(xì)菌的脂蛋白和其他胞壁結(jié)構(gòu)［5］。

1.2 TLRs信號(hào)傳導(dǎo)通路

在與配體結(jié)合后，TLRs的結(jié)構(gòu)發(fā)生二聚化，由此激發(fā)TOLL/IL-1受體結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)區(qū)(Toll-IL-1 receptor domain，TIR)與胞內(nèi)銜接分子的相互作用從而激活信號(hào)傳導(dǎo)，引起致炎細(xì)胞因子的釋放，激發(fā)固有免疫應(yīng)答。TLRs信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)包括髓樣分化因子88(Myeloid differentiation primary-response protein 88，MyD88)依賴型以及MyD88非依賴型通路。

MyD88依賴型TLRs信號(hào)通路活化IL-1受體相關(guān)激酶，而后聯(lián)合腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 (tumor-necrosis-factor receptor-associated factor 6，TRAF6)激活兩條不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。其中之一是通過活化絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)激活活化蛋白-1，并通過中介蛋白ECSIT將TRAF6與MAPK通路聯(lián)系起來，激活JNK、p38等通路。另一條則是通過激活轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶/轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶結(jié)合蛋白-1復(fù)合體，從而上調(diào)核因子κB抑制蛋白激酶復(fù)合物(inhibitor of nuclear factor-κB kinase complex，IKK)的活性。一旦IKK被激活，其發(fā)生磷酸化并導(dǎo)致核因子κB抑制蛋白(IκB)的降解及核因子κB(nuclear facto κ，NF-κB)的釋放。隨之NF-κB轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和趨化因子的釋放，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和啟動(dòng)固有免疫。

盡管大多數(shù)TLRs調(diào)節(jié)反應(yīng)基于MyD88依賴型通路，但TLR3和TLR4卻是通過MyD88非依賴通路活化干擾素調(diào)節(jié)因子-3(interferon(IFN)-regulatory factor-3，IRF-3)誘導(dǎo)IFN-1的表達(dá)［6］。研究表明:LPS作用于MyD88基因缺陷小鼠，仍然可以誘導(dǎo)該鼠NF-κB和JNK的激活，提示存在一種MyD88非依賴性信號(hào)傳導(dǎo)途徑就能夠介導(dǎo)LPS的作用產(chǎn)生炎癥因子。目前研究表明:具體的TLR所調(diào)節(jié)的信號(hào)通路能特異地選擇接頭分子以激活MyD88依賴性或MyD非依賴性途徑。

2 TLRs在正常牙周組織中的作用

2.1 TLRs在正常牙周組織中的表達(dá)

TLRs主要表達(dá)于包括中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在內(nèi)的固有免疫系統(tǒng)細(xì)胞。作為血液系統(tǒng)最主要的固有免疫細(xì)胞，中性粒細(xì)胞能在第一時(shí)間轉(zhuǎn)移至感染部位，依賴相關(guān)的TLRs識(shí)別各種微生物的入侵并產(chǎn)生免疫應(yīng)答。中性粒細(xì)胞表達(dá)除TLR3以外的所有TLRs［7］。單核巨噬細(xì)胞表達(dá)TLR1、TLR2以及TLR4-8，PAMP與單核細(xì)胞的結(jié)合能夠影響適應(yīng)性免疫反應(yīng)的類型［8］。樹突狀細(xì)胞表達(dá)多種TLRs，TLRs通過與病原體的相互作用激活樹突狀細(xì)胞，由此誘導(dǎo)對(duì)T細(xì)胞增殖及分化具有重要意義的大量共刺激分子的表達(dá)以及細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生［9］。

牙周組織是包括牙齦、牙骨質(zhì)、牙周膜以及牙槽骨的牙齒支持結(jié)構(gòu)。組織學(xué)檢測顯示:在齦溝液及牙齦上皮細(xì)胞層存在少量免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞?，F(xiàn)已明確:在牙周疾病組織中能檢測到T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞游出［9］。目前已發(fā)現(xiàn)作為適應(yīng)性免疫應(yīng)答細(xì)胞，T、B淋巴細(xì)胞均表達(dá)TLRs。牙齦卟啉單胞菌LPS可直接刺激B1細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。T細(xì)胞表面TLRs與其配體的結(jié)合能直接調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能，促進(jìn)其增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而CD25+CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面TLRs的活化能調(diào)節(jié)其抑制活性［10］。

牙齦上皮能夠保護(hù)其下的牙周組織免受口腔致病微生物和其他有害因子的影響，在保持牙周內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用。通過對(duì)人牙齦活體組織上皮細(xì)胞TLRs表達(dá)的檢測，發(fā)現(xiàn)牙齦上皮細(xì)胞表達(dá)TLR2-6以及TLR9［11］。牙齦成纖維細(xì)胞表達(dá)TLR1-9mRNA和其他TLRs相關(guān)分子，例如CD14 (一種脂多糖的共受體)、MyD88、NOD1［12］。比較來自同一志愿者的牙齦成纖維細(xì)胞與牙周膜成纖維細(xì)胞，后者較前者表達(dá)更高水平的TLR2以及更低水平的CD14［13］。這種差異性提示兩種細(xì)胞在對(duì)菌斑細(xì)菌反應(yīng)上可能具有一定的功能差異。成骨細(xì)胞是骨形成細(xì)胞，且對(duì)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的活化與分化方面有著重要作用。Nemoto E等的研究表明:鼠成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞均表達(dá)TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR9、MD-2、CD14、NOD-1、NOD-2［14］。來自鼠骨髓的破骨細(xì)胞能夠表達(dá) TLR2、TLR4以及CD14的mRNA［15］。人微血管上皮細(xì)胞通常被認(rèn)作是一種相對(duì)惰性的血管內(nèi)皮細(xì)胞，但現(xiàn)已明確其在調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著積極的作用。而牙周膜正是一種包繞于牙根表面的高度血管化組織。這些細(xì)胞表達(dá)TLR1、TLR4、TLR5的mRNA，但不表達(dá)或少量表達(dá)TLR2 mRNA［16］。

2.2 TLR在維持牙周健康中的作用

研究已表明牙周組織細(xì)胞表達(dá)多種不同類型的TLRs，活躍參與了抗菌斑細(xì)菌的固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫的活化和調(diào)節(jié)。牙齦上皮細(xì)胞雖持續(xù)地暴露于至少500種口腔共生菌和致病菌中［2］，但卻能夠通過TLRs信號(hào)通路調(diào)節(jié)其反應(yīng)以維持自身穩(wěn)態(tài)。近來一些學(xué)者提出:長期暴露于細(xì)菌產(chǎn)物后的口腔黏膜。下調(diào)TLRs的表達(dá)并限制細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)，從而使其耐受性增強(qiáng)，但該推測已遭到質(zhì)疑。目前有研究證實(shí):在穩(wěn)定狀態(tài)下共生菌對(duì)TLRs的激活對(duì)維持口腔穩(wěn)態(tài)并保護(hù)其免受損傷至關(guān)重要。在穩(wěn)定環(huán)境下牙齦上皮(特別是齦牙結(jié)合區(qū))表達(dá)的TLRs與牙表面菌斑細(xì)菌產(chǎn)物持續(xù)作用，該TLRs信號(hào)通路引起固有免疫反應(yīng)導(dǎo)致抗菌肽(β防御素，抗菌肽，鈣防衛(wèi)蛋白)和中性粒細(xì)胞趨化因子IL-8的釋放［17］。由此認(rèn)為，TLRs信號(hào)通路能抑制致病性感染并阻礙共生微生物穿透上皮屏障從而維持了牙齦健康。對(duì)牙齦上皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞及其在穩(wěn)態(tài)下應(yīng)對(duì)口腔菌斑細(xì)菌反應(yīng)的交互作用更為深入的研究，能很大程度上加深對(duì)牙周膜如何通過TLRs信號(hào)通路激活固有免疫反應(yīng)而不表露炎癥狀態(tài)這一問題的認(rèn)識(shí)。

3 TLRs在牙周疾病中的作用

3.1 TLRs在單純性牙周疾病中的作用

牙周炎是由菌斑微生物所引起的牙周支持組織的慢性感染性疾病，可引起牙周袋的形成、進(jìn)行性附著喪失和牙槽骨吸收，最終導(dǎo)致牙齒脫落。高水平致病菌及其毒性產(chǎn)物侵襲后齦牙結(jié)合部上皮屏障的破壞是菌斑誘導(dǎo)型牙周炎發(fā)生的可能開端。在牙周組織中，PAMP對(duì)TLRs的慢性刺激能夠引起大量前致炎因子、調(diào)節(jié)分子的產(chǎn)生并導(dǎo)致組織破壞。

Sun Y等(2010)發(fā)現(xiàn):中國人慢性牙周炎患者牙齦組織和齦溝液中TLR2、TLR4、CSF2、LY64的mRNA以及蛋白表達(dá)量均高于健康人［18］。Scheres等(2011)亦證實(shí)，牙周炎患者牙周膜成纖維細(xì)胞中TLR1、TLR4、TLR7和CD14的表達(dá)水平高于健康人，而且牙周炎患者的牙周膜和牙齦成纖維細(xì)胞對(duì)牙齦卟啉單胞菌的刺激較健康者表現(xiàn)出更高的活性。用牙齦卟啉單胞菌LPS在體外刺激人牙齦成纖維細(xì)胞，能使其表達(dá)更高水平的TLR1、TLR2、TLR7［19］。前致炎因子 IFN-γ亦能上調(diào)人牙齦成纖維細(xì)胞TLR2 mRNA和蛋白的表達(dá)［20］。用腸道沙門氏菌和伴放線放線桿菌 A的 LPS刺激經(jīng)IFN-γ預(yù)處理過的CD14高表達(dá)的牙齦成纖維細(xì)胞，能通過增強(qiáng)的TLR-4通路誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生更多IL-8［21］。牙齦卟啉單胞菌LPS和IFN-γ能夠增強(qiáng)TLR2、TLR4、CD14、MD-2的表達(dá)，這表明TLR通路在放大牙周結(jié)締組織炎癥反應(yīng)中可能具有重要作用。

牙周炎患者的牙骨質(zhì)會(huì)受到菌斑生物膜中G-病原菌的入侵。Nemoto E等(2000)的研究表明:在脂質(zhì)A(TLR4配體)、CpG DNA(TLR9配體)或Pam3CSK4(TLR-1/2配體)刺激下，鼠成牙骨質(zhì)細(xì)胞的NF-κB通路途徑被激活，從而導(dǎo)致IL-6的產(chǎn)生［14］。牙槽骨再生為破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞兩者的平衡所調(diào)節(jié)。細(xì)菌產(chǎn)物和宿主調(diào)節(jié)因子(IL-1，TNF-a，前列腺素E2等)通過抑制成骨細(xì)胞的生成及其活性，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞激活而導(dǎo)致骨的吸收。牙齦卟啉單胞菌LPS能上調(diào)骨橋素(OPN)與骨保護(hù)素(OPG)但下調(diào)NF-κB受體活化因子配體(RANKL)的表達(dá)。該反應(yīng)能被TLR4/MD-2抗體所阻斷，這表明TLR4信號(hào)通路在其中的作用［22］。TLR4和TLR9信號(hào)通路均能刺激鼠成骨細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，這亦提示需進(jìn)行更多研究以探明TLR在骨重建過程中的作用。

牙周膜是包繞牙根表面的高度血管化組織。有研究表明:TLR4能激活血管內(nèi)皮產(chǎn)生大量前致炎因子和趨化因子［23-24］。TLR4配體，LPS以及前致炎因子諸如IFN-γ及TNF-α均能上調(diào)人內(nèi)皮細(xì)胞TLR2的表達(dá)［25］。LPS和IFN-γ亦能上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)［26］。

3.2 TLRs在伴有全身性病的牙周病中的作用

致病微生物是引發(fā)牙周病的始動(dòng)因素。但全身因素亦可以改變宿主對(duì)局部因素的反應(yīng)，影響并調(diào)控疾病的發(fā)生和發(fā)展。反之，牙周病局部病變所產(chǎn)生的致炎因子等又是全身性病的重要加重因素。

大量證據(jù)表明:糖尿病能夠增加牙周病的風(fēng)險(xiǎn)并加速其發(fā)展進(jìn)程。而慢性炎癥或感染似乎能增強(qiáng)胰島素抵抗，并由此促進(jìn)糖尿病及其并發(fā)癥的形成。Rojo-Botello NR等(2012)的研究表明:牙周炎患者牙齦組織中TLR2、3、4、9的水平高于健康對(duì)照組;而伴有糖尿病的牙周炎患者結(jié)締組織中TLR2，TLR9、上皮區(qū)TLR4表達(dá)量明顯高于不伴有糖尿病的牙周炎患者［27］。人們普遍認(rèn)為適量的脂肪酸能夠通過TLR4通路促使炎癥的發(fā)生發(fā)展，而該炎癥狀態(tài)能夠增強(qiáng)胰島素抵抗。Watanabe K等(2011)發(fā)現(xiàn)，高糖飼養(yǎng)的患有牙周炎并TLR4功能缺失(loss-of-function，LOF)的小鼠較野生型小鼠表現(xiàn)出更強(qiáng)的葡萄糖耐受性和更低水平的肝內(nèi)TNF-α mRNA和下頜骨骨喪失，提示牙周炎可能通過TLR4調(diào)節(jié)胰島素分泌;而TLR4的功能缺失或許能維持肝臟對(duì)胰島素的敏感性和增強(qiáng)葡萄糖的體內(nèi)平衡［28］。

研究表明:吸煙者較不吸煙者易患牙周炎且更易發(fā)展為重癥牙周炎及難治性牙周炎［29］。但吸煙者對(duì)牙菌斑刺激卻表現(xiàn)出相對(duì)輕微的臨床炎癥，如水腫和探診出血均較輕［30-31］。Juhi Bagaitkar等(2010)研究表明:牙齦卟啉單胞菌能通過改變自身多組基因及上調(diào)外膜蛋白(FimA)適應(yīng)煙草萃取液造成的壓力環(huán)境［32］，并抑制I-κBα的降解，降低TLR2的敏感性而使致炎因子的產(chǎn)生減少［33］。

不僅有論據(jù)支持牙周病與某些全身性疾病存在相關(guān)性，而且伴有全身疾病的牙周炎患者的TLRs、致炎因子及細(xì)胞因子均較不伴有全身疾病的牙周炎者和健康者高，提示TLR在上述全身性病與牙周病雙向影響中可能有一定的作用。未來需做更多研究以探明牙周病與全身性病相互影響的可能機(jī)制。

4 小結(jié)

綜上所述，由于牙齦上皮細(xì)胞持續(xù)地暴露于大量口腔共生菌和致病菌中，使TLRs信號(hào)通路激活而激發(fā)了固有免疫反應(yīng)，能夠促進(jìn)抗菌肽及中性粒細(xì)胞趨化因子IL-8的釋放，抑制致病性感染并阻礙共生微生物穿透上皮屏障，從而維持了牙齦健康。另一方面，高水平的致病菌及其毒性產(chǎn)物侵襲后齦牙結(jié)合部上皮屏障被破壞，使得細(xì)菌成分能夠通過TLRs信號(hào)通路激活上皮下層和結(jié)締組織中的其他細(xì)胞，諸如抗原呈遞細(xì)胞(朗格漢斯細(xì)胞，間質(zhì)性DC)、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及破骨細(xì)胞等。這些被激活的細(xì)胞能產(chǎn)生一系列的細(xì)胞因子、趨化因子及其他調(diào)節(jié)分子，進(jìn)一步促進(jìn)了炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞的游出。游出的記憶性T細(xì)胞能夠產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子，以放大炎性反應(yīng)并導(dǎo)致結(jié)締組織和骨組織的破壞。因此牙周膜如何在炎性反應(yīng)中維持自身穩(wěn)態(tài)和避免自身破壞是頗值深思的問題。TLR在固有免疫系統(tǒng)中的作用的深入探討必將會(huì)為牙周炎這一感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展研究提供新的視角。

另外，牙周炎是極其復(fù)雜且多因素參與的疾病，其與許多全身性病具有雙向影響。伴有全身疾病的牙周炎患者的TLRs、致炎因子及細(xì)胞因子均高于不伴有全身性病牙周炎者和健康者，可能為全身性病與牙周病雙向影響機(jī)制提供了切入點(diǎn)與可能依據(jù)。

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