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    鏈霉菌TD-1菌株抑菌活性物質(zhì)發(fā)酵條件的優(yōu)化

    2012-12-07 07:21:54楊曉靜王昌祿王志芳李風(fēng)娟陳勉華王玉榮
    關(guān)鍵詞:黃豆粉氮源碳源

    楊曉靜, 王昌祿, 王志芳, 李風(fēng)娟, 陳勉華, 王玉榮

    (天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室/食品科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

    鏈霉菌TD-1菌株抑菌活性物質(zhì)發(fā)酵條件的優(yōu)化

    楊曉靜, 王昌祿, 王志芳, 李風(fēng)娟, 陳勉華, 王玉榮

    (天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室/食品科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

    利用正交設(shè)計法及均勻設(shè)計法對鏈霉菌TD-1菌株發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,研究不同發(fā)酵因子對鏈霉菌TD-1產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響.結(jié)果表明,發(fā)酵培養(yǎng)基中影響抑菌活性大小的主要因素為葡萄糖、黃豆粉、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀及硝酸鉀;抑菌活性物質(zhì)較佳發(fā)酵條件為90 mL/250 mL三角瓶,接種量的體積分?jǐn)?shù)為0.06,發(fā)酵周期8 d,初始pH值為7.15.在此條件下,最終抑菌效率與原發(fā)酵液相比發(fā)酵液對串珠鐮刀菌抑菌活性提高了53.38%.

    王昌祿,男,教授,主要從事食品生物技術(shù)方面的研究.通訊作者.

    鏈霉菌TD-1;抑菌活性物質(zhì);發(fā)酵條件

    真菌及其毒素能通過糧食、飼料和畜產(chǎn)品等途徑危害人類及動物健康,其中鐮孢菌屬(Fusarium)中的串珠鐮刀菌是糧食及飼料中的常見霉菌,其嚴(yán)重性已經(jīng)被人們所公認(rèn).如何抑制糧食、飼料中霉菌及其毒素,減輕其危害,已成為眾多學(xué)者研究的熱點[1-2].在對真菌及其毒素的防治中,化學(xué)防霉防腐劑發(fā)揮著舉足輕重的作用.但由于過量使用化學(xué)防霉防腐劑引起的一系列環(huán)境及社會問題越來越引起人們的重視,我國政府將重點致力于生物殺蟲劑、殺菌劑的研究與產(chǎn)業(yè)化[3].

    據(jù)統(tǒng)計,目前已獲得的天然產(chǎn)物化合物總量已超過100萬種,其中微生物代謝產(chǎn)物約為2萬多種[4],而從微生物代謝產(chǎn)物中分離得到的活性化合物直接使用的有150~160個[5-6].放線菌是重要的微生物資源,其產(chǎn)生的活性成分具有周期短、易于研究、無毒無害等優(yōu)點,一直是研究者關(guān)注的焦點[7-10].特別是鏈霉菌能產(chǎn)生多種防霉防腐的活性物質(zhì)[11-12].本研究在前期研究[13-14]的基礎(chǔ)上,對能夠抑制多種產(chǎn)毒素霉菌的鏈霉菌TD-1菌株產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)的發(fā)酵條件及最佳培養(yǎng)基配方進(jìn)行了優(yōu)化.

    1 材料與方法

    1.1 材料與設(shè)備

    1.1.1 菌株

    實驗菌株:鏈霉菌TD-1,從天津市寶坻區(qū)某飼料廠儲糧倉庫周圍土壤中篩選獲得.

    指示菌株:串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme),由天津市畜牧獸醫(yī)研究所提供.

    1.1.2 培養(yǎng)基

    液體發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉20.0 g,黃豆粉10.0 g,KNO31.0 g,K2HPO40.5 g,NaCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g ,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g,自來水1 000.0 mL,pH 值為7.2~7.4;121℃,滅菌20 min.

    1.1.3 試劑

    碳源為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、檸檬酸三鈉、乙酸鈉、可溶性淀粉;氮源為蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、黃豆粉、尿素、硫酸銨、硝酸銨;無機(jī)鹽為氯化鈣、硫酸亞鐵、硝酸鉀、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈉、氯化鉀.

    1.1.4 儀器

    1類B型超凈工作臺,上海博訊事業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌器,上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司;HYG-III型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜,上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司;牛津杯,外徑8 mm,上海黃海藥檢儀器銷售有限公司.

    1.2 方法

    1.2.1 發(fā)酵液的制備

    28℃培養(yǎng)3~4 d活化TD-1菌株,刮取孢子制成菌懸液,接種于裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,28~30℃,180 r/min搖床中培養(yǎng)5~6 d.

    1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化

    1.2.2.1 無機(jī)鹽正交試驗

    以串珠鐮刀菌為指示菌,以氯化鈣、硫酸亞鐵、硝酸鉀、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈉、氯化鉀7種無機(jī)鹽作為實驗因素,選用正交設(shè)計表L18(37),各因素設(shè)定3個水平(如表1),牛津杯法[15-16]測定不同濃度無機(jī)鹽對TD-1菌株產(chǎn)抑菌活性的影響.

    表1 各因素試驗水平Tab.1 Level of each factor g·(100 mL_-1)

    1.2.2.2 培養(yǎng)基成分正交試驗

    選用正交設(shè)計表中L9(34),以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、檸檬酸三鈉、乙酸鈉作為碳源因素,以蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、黃豆粉、尿素、硫酸銨、硝酸銨作為氮源因素,經(jīng)單因素試驗選用較優(yōu)碳、氮源作為培養(yǎng)基成分正交試驗因素;在無機(jī)鹽正交實驗的基礎(chǔ)上,選用較優(yōu)無機(jī)鹽作為培養(yǎng)基成分正交因素,每個因素分別設(shè)置3個濃度水平,確定優(yōu)化后的鏈霉菌菌株TD-1發(fā)酵培養(yǎng)基成分.

    1.2.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化

    選取對菌株TD-1產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)影響較大的4個發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,4個主要條件為:裝液量、接種量、發(fā)酵時間、pH值.從均勻設(shè)計表中選用表,每個因素水平設(shè)為10.

    1.2.4 優(yōu)化效果對比試驗

    根據(jù)上述實驗結(jié)果,菌株TD-1分別在優(yōu)化發(fā)酵條件、最優(yōu)培養(yǎng)基條件下和原始發(fā)酵條件、原始培養(yǎng)基條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),以串珠鐮刀菌為指示菌,牛津杯法測定2種發(fā)酵條件對菌株TD-1產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響,實驗重復(fù)進(jìn)行3次,取平均值作為最終結(jié)果,比較優(yōu)化后抑菌效果提高率.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

    2.1.1 無機(jī)鹽對菌株TD-1發(fā)酵液活性的影響

    選用不同的無機(jī)鹽進(jìn)行正交試驗,結(jié)果如表2,比較各因素的極差R可知,硝酸鉀(R,1.57)、水合硫酸亞鐵(R,1.28)及磷酸氫二鉀(R,1.23)為影響發(fā)酵液抑菌活性的主要因素;試驗各因素水平的平均數(shù)表明對菌株TD-1發(fā)酵液抑菌物質(zhì)影響較大的是硝酸鉀、水合硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀.

    表2 無機(jī)鹽正交試驗結(jié)果Tab.2 Data of orthogonal test of inorganic salts mm

    2.1.2 碳源對菌株TD-1產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響

    選取葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、檸檬酸鈉、乙酸鈉為碳源,測定其對抑菌活性的影響.結(jié)果表明,等量替換原始發(fā)酵培養(yǎng)基中的可溶性淀粉時,其抑菌效果由大到小依次為葡萄糖>檸檬酸鈉>甘油>蔗糖>麥芽糖>乙酸鈉(如圖1).所選碳源均能使菌株TD-1發(fā)酵液產(chǎn)生抑菌活性,其中葡萄糖為碳源時,產(chǎn)生的抑菌活性最大,抑菌圈直徑達(dá)19.8 mm,故選葡萄糖代替淀粉作為碳源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基配方的進(jìn)一步優(yōu)化.

    圖1 碳源對抑菌活性物質(zhì)活性的影響Fig.1 Influence of different carbon sources on antifungal activity

    在測定不同碳源對菌株TD-1抑菌活性影響的基礎(chǔ)上,將抑菌活性較高的葡萄糖、甘油、檸檬酸三鈉3種碳源分別按質(zhì)量濃度為0.02,0.05,0.08 g/mL加入到培養(yǎng)基中作為碳源,進(jìn)行單因素濃度對抑菌活性的測定,結(jié)果如圖2.隨葡萄糖濃度的增大,抑菌效果先增大后減小,這可能是由于胞外滲透壓過大培養(yǎng)基中碳氮比例失衡引起的;而甘油和檸檬酸三鈉質(zhì)量濃度為0.02 g/mL時,抑菌效果最好.甘油隨質(zhì)量濃度的增大,抑菌物質(zhì)活性有所下降,這可能與發(fā)酵液粘度過大不利于發(fā)酵造成的,檸檬酸三鈉質(zhì)量濃度為0.08 g/mL時抑菌物質(zhì)活性有所回升,但用量過大不利于發(fā)酵.從經(jīng)濟(jì)性考慮,選用葡萄糖質(zhì)量濃度為0.05 g/mL時為最宜.

    2.1.3 氮源對菌株TD-1產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響

    選用蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、尿素、硫酸銨、硝酸銨為氮源,以黃豆粉作為對照,測定其對抑菌活性的影響.結(jié)果表明,在以酵母浸粉、硫酸銨作為氮源時,菌株TD-1發(fā)酵培養(yǎng)時不能合成抑菌活性物質(zhì),發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化時不再考慮此2種氮源.其他氮源對抑菌活性的測定,結(jié)果如圖3,其中以牛肉膏產(chǎn)生抑菌物質(zhì)活性最大,抑菌圈直徑達(dá)18.0 mm.各不同氮源抑菌效果由大到小依次為黃豆粉>蛋白胨>硝酸銨>尿素(如圖3).

    圖2 不同質(zhì)量濃度碳源對抑菌物質(zhì)活性的影響Fig.2 Influence on active substance production of different concentration carbon

    圖3 氮源對抑菌物質(zhì)活性的影響Fig.3 Influence of different nitrogen sources on antifungal activity

    在測定不同氮源對菌株TD-1抑菌活性影響的基礎(chǔ)上,將抑菌活性較好的蛋白胨、牛肉膏、黃豆粉,分別按質(zhì)量濃度為0.01,0.025,0.04 g/mL加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中,檢測結(jié)果如圖4.黃豆粉作為氮源時,隨用量增大抑菌效果先增大后減小,當(dāng)質(zhì)量濃度為0.01 g/mL時,抑菌圈最大;質(zhì)量濃度為0.04 g/mL時,抑菌活性下降.蛋白胨隨質(zhì)量濃度的增大抑菌活性反而降低.牛肉膏在質(zhì)量濃度增大時,抑菌物質(zhì)活性隨之增大,但成本過高,故選黃豆粉質(zhì)量濃度為0.01 g/mL時為較佳條件.

    圖4 不同質(zhì)量濃度氮源對抑菌物質(zhì)活性的影響Fig.4 Influence on active substance production of different concentration nitrogen

    2.1.4 培養(yǎng)基成分正交試驗

    在碳氮源單因素及無機(jī)鹽正交試驗基礎(chǔ)上,分別選用對抑菌活性物質(zhì)影響較大的碳源(葡萄糖)、氮源(黃豆粉)及無機(jī)鹽(水合硫酸亞鐵與磷酸氫二鉀)進(jìn)行正交試驗,通過正交L9(34)設(shè)計,得出結(jié)果如表3,從各因素的R值看出,培養(yǎng)基成分影響抑菌活性產(chǎn)生的主次順序為:水合硫酸亞鐵與磷酸氫二鉀組合(R,3.6)> 葡萄糖(R,3.3)>硝酸鉀(R,2.5)>黃豆粉(R,1.1),分析k值可知4種因素的最優(yōu)配比水平為:葡萄糖65 g/L,硝酸鉀0.5 g/L,磷酸氫二鉀1 g/L,水合硫酸亞鐵0.01 g/L.

    表3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化最終正交試驗結(jié)果Tab.3 Data of final fermentation optimization g·(100 mL -1)__

    對以上結(jié)果進(jìn)行F值顯著性檢驗,結(jié)果如表4,分析可知水合硫酸亞鐵與磷酸氫二鉀組合、葡萄糖對菌株TD-1發(fā)酵液產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)影響較大,即2種因素對實驗結(jié)果有顯著差異性,其中水合硫酸亞鐵與磷酸氫二鉀組合與葡萄糖相比,對菌株TD-1發(fā)酵液產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響較大.根據(jù)前期實驗室對菌株TD-1的研究,此結(jié)果可能與TD-1菌株本身的生物學(xué)特性有關(guān)[13].

    綜上所述,優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為葡萄糖65 g/L、黃豆粉10 g/L、硝酸鉀0.5 g/L、水合硫酸鎂1 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、氯化鈉0.5 g/L、氯化鉀0.2 g/L、水合硫酸亞鐵0.01 g/L.

    表4 發(fā)酵培養(yǎng)基配方F檢驗Tab.4 F-test of composition of fermentation medium

    2.2 培養(yǎng)條件對菌株TD-1產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響

    在培養(yǎng)基成分優(yōu)化的基礎(chǔ)上進(jìn)行均勻試驗設(shè)計,選取對菌株TD-1發(fā)酵影響較大的4組培養(yǎng)條件:裝液量、接種量、培養(yǎng)時間及pH,測定各培養(yǎng)條件不同水平下對抑菌活性大小的影響,結(jié)果如表5,通過DPS軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行偏最小二乘回歸建模分析,最終得到菌株TD-1較優(yōu)培養(yǎng)條件為:搖瓶裝液量90 mL/250 mL三角瓶、接種量的體積分?jǐn)?shù)為0.06、發(fā)酵周期8 d、初始pH值7.15,其他培養(yǎng)條件不變.從偏最小二乘回歸方程

    得菌株TD-1理論上的抑菌值為30.36 mm.

    表5 均勻設(shè)計試驗結(jié)果Tab.5 Data of uniform test

    表6 優(yōu)化發(fā)酵結(jié)果與原始發(fā)酵結(jié)果抑菌效果對比Tab.6 Comparison between optimizated results and original fermentation

    2.3 優(yōu)化發(fā)酵結(jié)果與原始發(fā)酵結(jié)果抑菌效果判斷

    分別測定菌株TD-1在優(yōu)化前后的發(fā)酵條件產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的大小,結(jié)果如表6.由表6可知,優(yōu)化后TD-1抑菌效果由原來的17.3 mm增大到優(yōu)化后的26.6 mm,抑菌率提高了53.3%.優(yōu)化后實驗結(jié)果為26.6 mm,與偏最小二乘回歸方程得到的理論值30.3 mm之間的相對偏差為5.8%,小于10%,說明均勻試驗得到的回歸方程較好的反映了實際情況,對實際生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義.

    3 討論

    通過實驗,確定了培養(yǎng)基中不同成分對鏈霉菌菌株TD-1產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響,通過極差R判斷,影響因素主次排列順序為:水合硫酸亞鐵與磷酸氫二鉀組合(R,3.6)>葡萄糖(R,3.3)>硝酸鉀(R,2.5)>黃豆粉(R,1.1),并得出較佳培養(yǎng)條件為搖瓶裝液量90 mL/250 mL三角瓶,接種量的體積分?jǐn)?shù)為0.06,發(fā)酵周期 8 d,初始 pH值7.15,抑菌物質(zhì)的活性較優(yōu)化前提高了53.38%.以上結(jié)果為TD-1菌株進(jìn)行發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)提供了依據(jù).

    菌株TD-1所產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)對飼料、糧食中霉菌有較強(qiáng)的抑制作用,在目前文獻(xiàn)資料的報道中較為少見,該抑菌活性物質(zhì)有望成為新型的微生物源農(nóng)藥,用于儲糧及飼料儲藏中霉菌防治必將有廣闊的發(fā)展前景.后續(xù)工作中需繼續(xù)根據(jù)菌株TD-1生長及產(chǎn)素的營養(yǎng)要求特點,在生物調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)上,進(jìn)行高密度大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng),提高活性物質(zhì)產(chǎn)量,降低生產(chǎn)成本.

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    (責(zé)任編輯:李 寧)

    Optimization of Fermentation Conditions for Antibacterial Activity Substance Produced by Streptomyces TD-1

    YANG Xiao-jing, WANG Chang-lu, WANG Zhi-fang, LI Feng-juan, CHEN Mian-hua, WANG Yu-rong
    (Key Laboratory of Food Nutrition and Safety of Ministry of Education/College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

    Fermenting conditions for antibacterial activity substance produced by Streptomyces TD-1 was optimized by orthogonal and homogeneous test design method.The effects of different experimental factors on Streptomyces TD-1 producing antibiotic substance were studied.The results showed that the most important factors which influence the antibacterial activity were glucose,soy flour,F(xiàn)eSO4,K2HPO4and KNO3;the optimized cultural conditions were the initial pH 7.15,culture temperature 30℃,6%of inoculum,the amount of shake flask 90 mL/250 mL,shaking speed 180 r/min and fermentation time 8 d.The final results showed that the antifungal activity of the fermentation broth could increase by 53.38%.

    Streptomyces TD-1;antibacterial activity substance;fermenting conditions

    1671-1513(2012)05-0046-06

    2012-01-15

    楊曉靜,女,碩士研究生,研究方向為食品生物技術(shù);

    TS205.9

    A

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