陳文娟, 陳建福
(1.漳州城市職業(yè)學院生物與環(huán)境工程系,福建漳州 363000;2.漳州職業(yè)技術學院食品與生物工程系,福建漳州 363000)
纖維素酶提取漳州血柚皮總黃酮的工藝研究
陳文娟1, 陳建福2
(1.漳州城市職業(yè)學院生物與環(huán)境工程系,福建漳州 363000;2.漳州職業(yè)技術學院食品與生物工程系,福建漳州 363000)
以漳州血柚皮為原料,利用纖維素酶對血柚皮總黃酮進行提取,并以硝酸鋁顯色法測定總黃酮提取率.分別對酶用量、pH值、酶解溫度、酶解時間進行單因素實驗和正交試驗,并通過極差、方差分析對提取過程顯著影響提取率的因素進行統(tǒng)計分析.結果表明,纖維素酶提取血柚皮中的總黃酮的優(yōu)選工藝條件為:酶用量5.5%,pH 5.2,酶解溫度52℃,酶解時間為50 min,該工藝條件下血柚皮總黃酮的提取率可達1.52%.
血柚皮;總黃酮;纖維素酶
平和紅肉蜜柚是一種由漳州平和傳統(tǒng)的琯溪蜜柚基因芽變而誕生的柚類新品種,素有“天然水果罐頭”之稱,因其肉色血紅,坊間有人形象地稱之為“血柚”,血柚所含的天然色素對人體具有一定的保健作用[1-3].血柚皮占整個血柚果質量的40%,血柚皮中還含有經(jīng)濟價值高的黃酮類化合物等活性成分,具有多種生物學活性和藥理作用,可作為消炎、抗病毒、抗過敏、鎮(zhèn)痛、降低血黏度和活血解痙類藥物的主要成分[4-7].酶法輔助提取是近年來廣泛應用的一種優(yōu)良的提取方法,纖維素酶能催化使植物組織細胞壁疏松、破裂,提高傳質系數(shù),具有生產能耗低,提取率高,環(huán)境污染小等優(yōu)點,在生物活性物質的提取方面越來越受到廣泛的重視[8-9].本文采用纖維素酶提取血柚皮中的總黃酮,并對提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化,為血柚皮的深加工提高副加值提供理論基礎.
電子天平,賽多利斯科學儀器有限公司;SHZD循環(huán)水式真空泵,鄭州長城科工貿有限公司;UV-2000型紫外可見分光光度計,尤尼柯(上海)儀器有限公司;旋轉蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州國華電器有限公司;DHG-9076A電熱恒溫鼓風干燥箱,上海精宏實驗設備有限公司.
纖維素酶,寧夏和氏璧生物技術有限公司;蘆丁標準品,上海滬宇生物試劑公司;乙醇,分析純,使用時,配制濃度(體積分數(shù),下同)為70%或80%的乙醇溶液;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純,使用時,配制成不同質量分數(shù)的溶液;鹽酸、磷酸鹽根據(jù)所需pH值配制成緩沖溶液;血柚皮,漳州市售血柚.
準確稱取105℃下干燥至恒重的蘆丁標準品10 mg,用80%的乙醇溶液溶解并定容至100 mL,搖勻得到100 mg/L標準品溶液.分別量取上述標準品溶液0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL 分別置于10 mL的容量瓶中,加0.3 mL質量分數(shù)為5%的NaNO2溶液,搖勻放置6 min,再加0.3 mL質量分數(shù)為10%的Al(NO3)3溶液,搖勻,放置6 min,再加4 mL質量分數(shù)為4%的NaOH溶液,搖勻放置20 min,加80%乙醇至刻度,搖勻,放置30 min,在510 nm波長處測定吸光度,并繪制總黃酮質量濃度與吸光度的標準曲線.
將市場采購的血柚剝皮,將血柚皮自然晾干,于50℃干燥箱中干燥至恒重,冷卻,粉碎,過100目篩備用.準確稱取備用的血柚皮粉末5 g,置于250 mL的燒瓶中,加入適量的酶(質量分數(shù),以血柚皮粉末量為基準,下同),以緩沖溶液調節(jié)pH值,在設置的條件下酶解,酶解結束后于95℃水浴5 min滅酶,抽濾,收集濾渣和濾液,備用.將酶解后的濾渣加入70%乙醇,在料液比1∶30,提取溫度60℃提取1 h,抽濾,濾液與酶解后得到的濾液合并置于旋轉蒸發(fā)器減壓濃縮,定容,按照1.2.1的方法,在510 nm下測定樣品液的吸光度,根據(jù)標準曲線的回歸方程,計算血柚皮中總黃酮的提取率,見公式(1).
式(1)中:C為按照標準曲線計算出的總黃酮質量濃度,mg/L;V為提取液體積,L;m為提取血柚皮的質量,g.
纖維素等多糖類物質被纖維素酶水解后,會導致細胞壁的部分破損、使得細胞膜變得疏松,增加了向主體溶劑擴散的擴散系數(shù),有利于細胞內的總黃酮類物質的浸提.在pH 5.5,酶解溫度55℃,酶解時間60 min的條件下,考察酶用量對血柚皮中總黃酮提取率的影響,其結果見圖1.
圖1 酶用量對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of enzyme concentration on extraction efficiency of total flavonoids
從圖1中可以看出,隨著纖維素酶用量的增加,總黃酮提取率增大,當酶用量達到0.6%時,提取率達到最大值,繼續(xù)增加酶的用量,提取率反而下降.這是因為隨著酶用量的增加,酶濃度增大,提高了酶促進反應速率,增大了酶對細胞壁的破壞能力,使得黃酮類物質提取率增加;但當酶用量達到0.6%時,溶液中底物的接觸點已被酶所飽和,繼續(xù)增加酶用量,酶的作用受到抑制;可能因為過量的酶包裹在血柚皮粒子表面阻礙黃酮類物質透過細胞膜進入水溶液而使其提取率下降.因此較佳的酶用量為0.6%.
酶是具有兩性電解質的一種蛋白質,酶分子依靠酸性或堿性氨基酸的側鏈基團而形成活性部位,pH值的變化將直接影響到酶的活化以及酶與底物的親和力.
在酶用量質量分數(shù)為0.6%,酶解溫度55℃,酶解時間60 min的條件下,考察溶液pH值對血柚皮中總黃酮提取率的影響,其結果見圖2.
圖2 酶解pH值對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of pH on extraction efficiency of total flavonoids
從圖2中可以看出,隨著pH值的升高,總黃酮提取率增加,當pH值達到5.5時,提取率達到最大,繼續(xù)增大pH值,總黃酮提取率卻急劇下降.這是因為當pH值小于5.5時,溶液中酸性太強,纖維酶的活性較低,總黃酮提取率較小;當pH值處于5.5時,纖維素酶處于較佳pH值狀態(tài),能夠發(fā)揮纖維素酶的最大活力,使得總黃酮提取率達到最大;當pH值大于6之后,總黃酮提取率急劇下降,這是因為酶分子在pH值大于6后,可能會引起酶空間結構的破壞,而引起酶的變性,使得底物不能與酶結合,使酶活力下降,導致總黃酮的提取率下降.因此,較佳的pH值為5.5.
在酶用量0.6%,pH 5.5,酶解時間60 min的條件下,考察酶解溫度對血柚皮中總黃酮提取率的影響,其結果見圖3.
圖3 酶解溫度對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on extraction efficiency of total flavonoids
從圖3中可以看出,隨著溫度的升高,酶的活性增大,總黃酮的提取率也增大,但當溫度超過55℃時,總黃酮提取率卻急劇下降,這是因為溫度較低時,酶的活性隨著溫度的升高而增大,反應速率增大,使得總黃酮提取率增大,當溫度超過55℃時,可能會使酶蛋白結構開始變化,酶活性減弱,并逐漸喪失催化能力,使得總黃酮提取率下降.因此適宜的酶解溫度為55℃.
在酶用量0.6%,pH 5.5,酶解溫度55℃的條件下,考察酶解時間對血柚皮總黃酮提取率的影響,其結果見圖4.
圖4 酶解時間對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of length of hydrolysis time on extraction efficiency of total flavonoids
從圖4中可以看出,隨著酶解時間的延長,總黃酮提取率增大,當酶解時間達到60 min時,總黃酮提取率達到最大,繼續(xù)延長酶解時間,總黃酮提取率反而下降.這是因為酶解時間太短時,酶活力尚未充分利用,隨著時間的延長,酶解反應比較完全,當酶解時間達到60 min時,血柚皮中的總黃酮幾乎溶出;繼續(xù)延長酶解時間,提取率不再增加,且時間過長容易導致黃酮類物質不穩(wěn)定發(fā)生分解或者轉化為其他物質.因此適宜的提取時間為60 min.
在單因素實驗的基礎上,選用L16(45)正交表進行正交試驗,以酶用量、pH值、酶解溫度、酶解時間為試驗因素,每個因素取4水平進行優(yōu)選,以總黃酮提取率為考察指標,并進行極差分析確定酶解法提取血柚皮中總黃酮的優(yōu)選工藝參數(shù),其結果見表1~3.
表1 正交試驗因素水平表L16(45)Tab.1 Factor levels of orthogonal experiments L16(45)
由表2的極差可知,影響纖維素酶水解法提取血柚皮中總黃酮的工藝中各影響因素的主次為:B>A>C>D,即pH值>酶用量>酶解溫度>酶解時間,優(yōu)選工藝為B4A2C4D2.將正交結果進一步進行方差分析如表3,從表3中方差分析可以看出,pH值和酶解溫度均有極顯著差異(F0>F0.01),而酶用量和酶解時間差異顯著(F0.05≤F0<F0.01).
酶用量各水平間差異顯著性SSR檢驗參見表4.
從表4的SSR檢驗可以看出,酶用量水平2與水平3和水平1存在顯著性差異(P<0.05),而與水平4之間存在極顯著差異(P<0.01).水平3和水平1之間不存在顯著性差異(P>0.05),但與水平4存在極顯著性差異(P<0.01),水平1和水平4之間存在著顯著性差異(P<0.05).所以較佳的酶用量為0.55%,其次為0.5%和0.6%,而0.65%不合適.
表2 總黃酮提取工藝正交試驗結果Tab.2 Orthogonal array design matrix and results
表3 正交試驗結果方差分析Tab.3 Variance analysis for orthogonal array design experimental results
表4 酶用量各水平間差異顯著性檢驗Tab.4 Notability difference in enzyme concentration with statistic method of SSR
pH值各水平間差異顯著性SSR檢驗參見表5.
表5 pH各水平間差異顯著性檢驗Tab.5 Notability difference pH with statistic method of SSR
從表5的SSR檢驗可以看出,pH值水平4與水平3不存在顯著性差異(P>0.05),而水平4和水平2存在顯著性差異(P<0.05),與水平1存在極顯著性差異(P<0.01).水平3和水平2不存在顯著性差異(P>0.05),但與水平1存在極顯著性差異(P<0.01),水平2與水平1存在極顯著差異(P<0.01).所以較佳的pH值為5.2和5.5,其次是5.8,而pH=6.0不合適.
酶解溫度各水平間差異顯著性的SSR檢驗參見表6.
表6 酶解溫度各水平間差異顯著性檢驗Tab.6 Notability difference in hydrolysis temperature with statistic method of SSR
從表6的SSR檢驗可以看出,酶解溫度水平4與水平3不存在顯著性差異(P>0.05),而與水平1和水平2存在極顯著性差異(P<0.01).水平3與水平1存在顯著性差異(P<0.05),而與水平2存在極顯著性差異(P<0.01).水平1與水平2之間不存在顯著性差異(P>0.05).所以較佳的酶解溫度為52℃和55℃,而58℃和60℃不適合.由于酶解溫度52℃和55℃不存在差異,從能源節(jié)約方面考慮,可將酶解溫度參數(shù)修正為52℃.
酶解時間各水平間差異顯著性的SSR檢驗參見表7.
表7 酶解時間各水平間差異顯著性檢驗Tab.7 Notability difference of length of hydrolysis time with statistic method of SSR
從表7的SSR檢驗可以看出,酶解時間水平2和水平1不存在顯著性差異(P>0.05),水平2與水平3存在顯著性差異(P<0.05),而與水平4存在極顯著性差異(P<0.01),水平1與水平3和水平4存在顯著性差異(P<0.05).水平3與水平4不存在顯著性差異(P>0.05).所以較佳的酶解時間為55 min和50 min,60 min和65 min不合適.由于酶解時間55 min和50 min不存在差異,從生產時間成本考慮,可將酶解時間參數(shù)修正為50 min.
取一定量的血柚皮樣品,根據(jù)正交極差法得到的較佳工藝條件和修正后的較佳工藝做3組平行實驗,總黃酮的提取率測定如表8.
表8 實驗結果驗證Tab.8 Experiment of best condition
從表8中可以看出,最佳的酶提取條件所測得的總黃酮提取率均大于正交設計表中其他提取條件下總黃酮的提取率,且提取條件修正對提取結果不會產生影響.
采用纖維素酶處理血柚皮,并提取血柚皮中的總黃酮,考察了酶用量、酶解pH值、酶解溫度、酶解時間對總黃酮提取率的影響.通過正交試驗,優(yōu)選出提取血柚皮總黃酮的較佳工藝條件為B4A2C4D2,即為酶解pH 5.2,酶用量0.55%,酶解溫度52℃,酶解時間55 min.方差分析顯示,酶解pH值和酶解溫度均有極顯著差異(F0>F0.01),而酶用量和酶解時間顯著差異(F0.05≤F0<F0.01).通過正交試驗各因素間的多重比較,表明較佳工藝參數(shù)為酶解pH 5.2,酶用量0.55%,酶解溫度52℃,酶解時間50 min.通過驗證較佳提取工藝B4A2C4D2和修正后的工藝B4A2C4D1的總黃酮提取率實驗結果一致,且總黃酮提取率均大于正交設計表中其他提取條件下總黃酮的提取率,該工藝可用于血柚皮中總黃酮的提取.
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(責任編輯:檀彩蓮)
Extraction of Total Flavonoids from Blood Pummelo Peel by Cellulase Hydrolysis
CHEN Wen-juan1,CHEN Jian-fu2
(1.Department of Biological and Environmental Engineering,Zhangzhou City University,Zhangzhou 363000,China;(2.Department of Food and Biology Engineering,Zhangzhou Institute of Technology,Zhangzhou 363000,China)
The total flavonoids from blood pummelo peel was prepared by cellulose enzyme hydrolysis,and the extraction yield was measured by coloration method with aluminum nitrate.The effects of parameters including enzyme concentration,pH,hydrolysis temperature and hydrolysis time on extraction yield were investigated by single factor test and orthogonal array design methods.And the notability difference was analyzed with the statistic method of range and variance.The results showed that the optimal conditions were as follows:the enzyme concentration was 5.5%,pH was 5.2,hydrolysis temperature was 52℃,and the hydrolysis time was 50 min.The extraction yield of the total flavonoids from blood pummelo peel reached up to 1.52%.
blood pummelo peel;total flavanoids;cellulase
TS201.2;R284.2
A
1671-1513(2012)05-0032-06
2012-05-15
福建省教育廳科技計劃項目(JB11310).
陳文娟,女,助教,碩士,主要從事食品科學與工程方面的研究;
陳建福,男,講師,博士,主要從事食品與生物工程方面的研究.通訊作者.