響應(yīng)面法優(yōu)化醋酸菌在梨渣中的發(fā)酵條件研究

張衛(wèi)華， 汪 超， 羅軍杰， 宋 娟， 陳茂彬， 李冬生

(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，湖北武漢 430068)

響應(yīng)面法優(yōu)化醋酸菌在梨渣中的發(fā)酵條件研究

張衛(wèi)華， 汪 超， 羅軍杰， 宋 娟， 陳茂彬， 李冬生

(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，湖北武漢 430068)

測定不同溫度、轉(zhuǎn)速、酒精濃度、接種量條件下醋酸菌在梨渣為主的半固體培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸量，觀察菌種的生長情況．采用響應(yīng)面法優(yōu)化醋酸菌生長條件．結(jié)果表明:醋酸菌較佳發(fā)酵條件為轉(zhuǎn)速136 r·min－1，溫度32℃，梨渣量28%，乙醇體積分?jǐn)?shù)3.6%，接種量4.0%．

醋酸菌;梨渣;總酸;響應(yīng)面分析

果醋是以蘋果、葡萄、柿子、梨、柑橘、獼猴桃、西瓜、山楂等水果，或果品加工下腳料為主要原料，利用現(xiàn)代生物技術(shù)釀制而成的一種營養(yǎng)豐富、口感優(yōu)良的酸味調(diào)味品及飲料［1］．果醋兼有水果和食醋的營養(yǎng)保健功能，是集營養(yǎng)、保健、食療等功能為一體的新型飲品［2－4］．目前市場上有大量的不同種類的果醋飲料，各類的占有率呈逐漸增加的趨勢．梨果中含有豐富的汁液，將其余下的果渣制成富含營養(yǎng)又具特色的果醋飲料，既可豐富食品種類，完善食物結(jié)構(gòu)，充分利用其資源，擴(kuò)大銷售范圍，又可進(jìn)一步調(diào)動(dòng)梨農(nóng)的生產(chǎn)積極性，促進(jìn)梨生產(chǎn)的更大發(fā)展．結(jié)合目前已有的研究成果，選取接種時(shí)梨渣用量、搖床轉(zhuǎn)速、乙醇濃度、接種量并在整個(gè)過程中控制發(fā)酵溫度，研究醋酸菌在梨渣中發(fā)酵的影響因素，為醋酸菌在不同環(huán)境下發(fā)酵的最適宜條件的確定提供一定的理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:實(shí)驗(yàn)室儲藏菌種．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 醋酸菌的培養(yǎng)和總酸測定

配制液體培養(yǎng)基［5］:葡萄糖1.0 g，酵母膏 1.0 g，碳酸鈣1.5 g，水100 mL，pH 自然，使用前加入2.0 mL無水乙醇;將儲藏菌種移植于斜面培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h．總酸［6］以醋酸計(jì)，g·L－1;酸堿滴定法參考國家標(biāo)準(zhǔn)［7］．

1.2.2 醋酸發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)

配制乙醇體積分?jǐn)?shù)為6.0%的液體培養(yǎng)基，裝液量100 mL，果渣量30%，醋酸菌接種量為4.0%，160 r·min－1、30 ℃ 搖床培養(yǎng)發(fā)酵，間隔 12 h 測定其總酸．

單因素變量分別為體積分?jǐn)?shù)2.0%，4.0%，6.0%，8.0%，10.0% 的乙醇;轉(zhuǎn)速 0，40，80，120，160，200 r·min－1，接 種 量 (V/V)2.0%，4.0%，6.0%，8.0%，10.0%;發(fā)酵溫度 24，28，32，36，40℃;果渣量(V/V)10%，30%，50%，70%，90%．發(fā)酵培養(yǎng)測定總酸含量．

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對產(chǎn)酸量的影響

乙醇濃度對產(chǎn)酸量的影響結(jié)果如圖1．由圖1可見，乙醇體積分?jǐn)?shù)為4.0%時(shí)，發(fā)酵總酸量達(dá)到最高，其次為6.0%．隨著乙醇濃度的持續(xù)升高，產(chǎn)酸量呈顯著下降趨勢．高濃度乙醇明顯抑制了醋酸菌的代謝［8］．

圖1 乙醇濃度對產(chǎn)酸量的影響Fig．1 Effect of alcohol concentration on acidity

2.2 轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酸量的影響

轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酸量的影響結(jié)果見圖2．圖2顯示，隨著轉(zhuǎn)速的增大，產(chǎn)酸量有所增加，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到160 r·min－1時(shí)，總酸量較高，轉(zhuǎn)速再繼續(xù)增加，產(chǎn)酸量無明顯上升趨勢．轉(zhuǎn)速越大，溶氧量越高［9］，利于醋酸菌發(fā)酵．

圖2 轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酸量的影響Fig．2 Effect of rotation rate on acidity

2.3 接種量對產(chǎn)酸量的影響

接種量對產(chǎn)酸量的影響結(jié)果見圖3．由圖3可知，接種量大小變化對產(chǎn)酸量影響并不明顯，前64 h內(nèi)總體趨勢變化不大，其后有小幅度上升．然而接種量過高或過低都會(huì)影響到醋酸菌的生長或產(chǎn)酸，綜合比較選取接種量為4.0%．

2.4 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酸量的影響

產(chǎn)酸速率與產(chǎn)酸量在發(fā)酵溫度為32℃時(shí)達(dá)到最大，見圖4．隨著溫度繼續(xù)上升，產(chǎn)酸量呈現(xiàn)下降趨勢，當(dāng)溫度為40℃時(shí)，幾乎不產(chǎn)酸．高溫對醋酸菌產(chǎn)生了抑制作用［10］．

圖3 接種量對產(chǎn)酸量的影響Fig．3 Effect of different inoculate quantity on acidity

圖4 溫度對產(chǎn)酸量的影響Fig．4 Effect of different temperature on acidity

2.5 果渣量對產(chǎn)酸量的影響

果渣量對產(chǎn)酸量的影響結(jié)果如圖5．由圖5可見，當(dāng)果渣量為30%時(shí)產(chǎn)酸量較大;當(dāng)果渣量為70%與90%時(shí)，產(chǎn)酸量降低，開始有下降的趨勢．

圖5 果渣量對產(chǎn)酸量的影響Fig．3 Effect of different pear slag weight on acidity

2.6 醋酸菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

由單因素實(shí)驗(yàn)得出，轉(zhuǎn)速、溫度、果渣量、乙醇濃度四個(gè)因素對產(chǎn)酸量的影響比較顯著，實(shí)驗(yàn)中每個(gè)因素選取3 個(gè)水平，以( －1，0，+1)作為編碼［11］，做試驗(yàn)因素水平表，得表1．

采用 SAS 軟件［12－13］，進(jìn)行 Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)［14］;做轉(zhuǎn)速、溫度、果渣量、乙醇濃度交互實(shí)驗(yàn)，以總酸度的平均值作為響應(yīng)值Y，最終得到結(jié)果如表2．

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平表Tab．1 Factors and Levels of Box-Behnken

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果Tab．2 Schedule and results of Box-Behnken

采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到模擬方程:

試驗(yàn)所得到的模型擬合度為96.31%，失擬度為92.00%，見表3，此模型擬合程度較為合理．

表3 回歸模型方差分析表Tab．3 Analysis of variance on regression model

從表3可看出，一次相X2及單因素二次項(xiàng)的P值＜0.01極顯著，一次相X3、X4及交互項(xiàng)X2X4的P值＜0.05顯著，說明溫度和乙醇濃度之間存在著交互作用，而非簡單的線性關(guān)系，溫度對乙醇極性產(chǎn)生一定的影響，且乙醇濃度與密度也隨之改變．影響產(chǎn)酸量單因素的顯著性次序X2＞X4＞X3＞X1，即溫度影響最大，轉(zhuǎn)速影響最?。?/p>

響應(yīng)面曲面上升越陡峭，等高線呈橢圓形，則兩因素之間交互作用顯著，見圖6．由圖6可知，固定X1，X3，等高線沿X2方向變化與沿X4方向變化較為陡峭，在實(shí)驗(yàn)水平下，發(fā)酵溫度和乙醇濃度兩個(gè)因素交互作用對總酸的影響顯著，而其余因素的交互作用不顯著，與表3方差分析結(jié)果一致．在溫度的變化下，對轉(zhuǎn)速與果渣量并無明顯影響，其相應(yīng)的交互作用并不顯著;而對乙醇極性產(chǎn)生一定的影響，且乙醇濃度與密度也隨之改變，交互影響顯著．

圖6 醋酸菌響應(yīng)面圖Fig．6 Response surface stereogram of acetic acid bacteria

由響應(yīng)面分析可知，回歸模型存在最大值Y的最大估計(jì)值為 2.673 1，其極值點(diǎn)代碼值為X( －0.058 0，0.196 0，－0.107 0，－0.122 2)，轉(zhuǎn)速136 r·min－1，溫度 32 ℃，果渣量 28%，乙醇體積分?jǐn)?shù)3.6%．

3 結(jié)論

1)單因素實(shí)驗(yàn)顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)為4.0% ～8.0%時(shí)，產(chǎn)酸量隨乙醇濃度的遞增而降低;轉(zhuǎn)速增大，產(chǎn)酸量隨之提高，160 r·min－1之后，轉(zhuǎn)速繼續(xù)增大對產(chǎn)酸量也有一定影響;溫度為20～32℃時(shí)，產(chǎn)酸速率隨溫度升高而升高;果渣量為30%時(shí)，產(chǎn)酸量達(dá)最大;接種量大小的變化對產(chǎn)酸量影響不明顯．

2)經(jīng)過SAS統(tǒng)計(jì)軟件分析得出，溫度對產(chǎn)酸量的影響最大，其次是乙醇濃度，轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酸量的影響最?。渲袦囟群鸵掖紳舛鹊慕换ビ绊懽顬轱@著．

3)較佳生產(chǎn)醋酸工藝條件:轉(zhuǎn)速136 r·min－1，溫度32℃，果渣量28%，乙醇體積分?jǐn)?shù)3.6%，接種量4.0%．在此條件下產(chǎn)酸量可達(dá)到較理想的狀態(tài)，72 h即可達(dá)到26.7 g/L．

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(責(zé)任編輯:葉紅波)

Optimization of Fermentation Conditions of Acetic Acid Bacteria in Pear Slag by Response Surface Analysis

ZHANG Wei-hua， WANG Chao， LUO Jun-jie， SONG Juan， CHEN Mao-bin， LI Dong-sheng
(School of Biological Engineering，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China)

Direct drinking vinegar，especially Fruit vinegar production is one of the most important way for deep processing of agricultural byproducts．This article is based on acetic acid bacteria was cultured under the conditions with different temperature，rotation rate，alcohol concentration，and inoculation．The total acid content was determined，and the growth of bacteria on the semisolid culture medium with pear slag was observed．Finally，response surface analysis was used to optimize the growth condition of acetic acid bacteria，and the optimum conditions were found as follows:rotation rate was 136 r·min－1，temperature was 32℃，the weight of the pear slag was 28%，alcohol content was 3.6%，inoculation was 4.0%．The result could provide a theory reference and practice basis for industrial production of the pear vinegar．

acetic acid bacteria;pear slag;total acid;response surface analysis

TS201.3

A

1671-1513(2012)01-0036-05

2011-10-21

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31071594)．

張衛(wèi)華，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵工藝;

汪超，男，副教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)方面的研究．通訊作者．