結(jié)核分枝桿菌MycP1蛋白的原核表達(dá)及其對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性作用*

黃丹丹，鮑 朗，楊曉玲，鄧儀昊，廖 丹

四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院感染免疫研究室成都 610041

#通訊作者，男，1954年6月生，博士，教授，研究方向:分子感染免疫，E-mail:baolang@scu.edu.cn

結(jié)核分枝桿菌MycP1蛋白的原核表達(dá)及其對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性作用*

黃丹丹，鮑 朗#，楊曉玲，鄧儀昊，廖 丹

四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院感染免疫研究室成都 610041

#通訊作者，男，1954年6月生，博士，教授，研究方向:分子感染免疫，E-mail:baolang@scu.edu.cn

結(jié)核分枝桿菌;MycP1;巨噬細(xì)胞;細(xì)胞毒性

目的:構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌MycP1蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)。方法:構(gòu)建pGEX-4T-1-Rv3883c重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，采用SDS-PAGE和Western blot法檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。目標(biāo)蛋白經(jīng)親和層析純化后，以不同質(zhì)量濃度MycP1作用于小鼠巨噬細(xì)胞ANA-1，48 h后XTT法檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)，同時(shí)測(cè)定細(xì)胞上清液中乳酸脫氫酶(LDH)活力，以評(píng)價(jià)其細(xì)胞毒性。結(jié)果:成功構(gòu)建pGEX-4T-1-Rv3883c質(zhì)粒，該質(zhì)粒能在大腸桿菌中表達(dá)，經(jīng)鑒定，表達(dá)的融合蛋白為目標(biāo)蛋白MycP1。該融合蛋白作用后可使ANA-1活細(xì)胞數(shù)下降(F=34.327，P＜0.001)，培養(yǎng)上清液中LDH活力升高(F=336.720，P＜0.001)。結(jié)論:成功構(gòu)建了MycP1原核表達(dá)系統(tǒng)，目標(biāo)蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞有一定的毒性效應(yīng)。

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的重大傳染病。近年來(lái)，由于多重耐藥和極端耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)以及與人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)的交叉感染等因素，結(jié)核病的發(fā)病率和病死率持續(xù)增加［1］，結(jié)核病流行呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)［2-4］。因此，對(duì)結(jié)核分枝桿菌致病機(jī)制的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

細(xì)菌的致病性依賴于其分泌毒力因子的能力。結(jié)核分枝桿菌具有高度復(fù)雜的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，其胞內(nèi)蛋白必須通過(guò)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)才能分泌至胞外環(huán)境，目前已報(bào)道［5-7］的分泌途徑有常規(guī)分泌途徑、雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和ESX-1分泌系統(tǒng)，其中ESX-1分泌系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。枯草桿菌樣絲氨酸蛋白酶MycP1是ESX-1系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)酶，該酶存在于結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁或膜上，由Rv3883c編碼，是ESX-1系統(tǒng)不可缺少的組成部分，而且是巨噬細(xì)胞感染早期不可缺少的毒力因子，也是目前結(jié)核藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)［8-10］。在卡介苗中Rv3883c同源基因不表達(dá)相關(guān)蛋白［11］。作者從結(jié)核分枝桿菌毒力株 H37Rv基因組中克隆、表達(dá)Rv3883c基因，將目的蛋白作用于小鼠巨噬細(xì)胞，觀察其細(xì)胞毒性效應(yīng)，為進(jìn)一步研究MycP1的功能及結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1、結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組及小鼠骨髓巨噬細(xì)胞株ANA-1均由該研究室常規(guī)保存。感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21(DE3)pLysS購(gòu)自Tiangen公司。

1.1.2 主要試劑 引物均由上海Invitrogen公司合成;Prime STAR高保真Taq DNA聚合酶、PCR試劑盒和DNA連接試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司;DNA限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ以及標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Ferments公司;其余質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收及PCR產(chǎn)物純化試劑盒、抗GST蛋白的單克隆抗體、羊抗鼠IgG-HRP二抗、蛋白純化柱、乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒、四氮唑復(fù)合物(XTT)、硫酸酚嗪甲酯(PMS)與文獻(xiàn)［12］相同。

1.2 pGEX-4T-1-Rv3883c質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定根據(jù)GenBank中的Rv3883c基因序列［13］，通過(guò)Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。Rv3883c基因上游引物(P1)序列 5’-GCgaattcCCCGCATCGGCCATCACG-3’，下游引物(P2)序列 5’-TTctcgagTCATCGGCG GCTCAGCG-3’(小寫(xiě)部分為酶切位點(diǎn))。PCR擴(kuò)增體系為:H2O 32.5 μL，5×PrimerSTAR Buffer(Mg2+plus)10 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)4 μL，P1、P2各1 μL，H37Rv基因組DNA 1 μL，Primer-STAR HS 0.5 μL，于Eppendorf Mastercycler Gradient PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性5 min;98℃變性10 s，61℃ 退火45 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸2 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，按DNA膠回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行純化，分別用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切純化產(chǎn)物和pGEX-4T-1質(zhì)粒，回收酶切產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行雙酶切鑒定、PCR鑒定和基因測(cè)序。

1.3 MycP1蛋白的原核表達(dá)和純化挑取單一克隆接種于5 mL含100 mg/L Amp的LB培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜后次日接種于相同培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)8 h后加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，25℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)夜。離心收集菌體，分別取上清和沉淀行SDS-PAGE電泳后，半干轉(zhuǎn)移儀轉(zhuǎn)膜，先后加入一抗(按1∶10 000稀釋的鼠抗GST單克隆抗體)、二抗(按1∶5 000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP)后DAB顯色。采用GSTrap親和層析柱純化融合蛋白，操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以BL21、BL21/pGEX-4T-1為對(duì)照。

1.4 MycP1融合蛋白對(duì)ANA-1細(xì)胞增殖的影響

1.4.1 ANA-1活細(xì)胞數(shù)的測(cè)定 采用XTT比色實(shí)驗(yàn)，方法見(jiàn)文獻(xiàn)［10］。收集ANA-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105mL－1，按100 μL/孔接種于96孔板中，加入融合蛋白至終質(zhì)量濃度分別為0、1、5、10、20、40 mg/L，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)5孔。37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后，滴加X(jué)TT和PMS混合液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，以此表示活細(xì)胞數(shù)。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH活力的測(cè)定 將 ANA-1細(xì)胞接種至106個(gè)/孔的6孔板中，36 h后加入融合蛋白至終質(zhì)量濃度分別為0、1、5、10、20、40 mg/L，每一質(zhì)量濃度重復(fù)5孔。48 h后檢測(cè)培養(yǎng)上清中LDH活力，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0處理數(shù)據(jù)，組間活細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)上清中LDH活力的比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 pGEX-4T-1-Rv3883c質(zhì)粒的鑒定以H37Rv基因組DNA為模板，以引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小約1 300 bp的特異性片段，與預(yù)期目的基因片段大小相符(圖1)。pGEX-4T-1-Rv3883c鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2，測(cè)序結(jié)果顯示連接方向?yàn)檎蜻B接，含有目的基因完整讀碼框序列。

圖3 融合蛋白的表達(dá)

2.2 MycP1融合蛋白的表達(dá)、純化與鑒定pGEX-4T-1-Rv3883c陽(yáng)性克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，在約74 000的相對(duì)分子質(zhì)量處出現(xiàn)一條明顯的蛋白表達(dá)條帶。該融合蛋白在胞內(nèi)以可溶形式表達(dá)，取裂解液上清后以親和層析柱純化，獲得了高純度的融合蛋白(圖3)，Western blot鑒定為MycP1(圖4)。

圖4 融合蛋白的免疫印跡分析

2.3 不同質(zhì)量濃度MycP1作用后ANA-1活細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)上清中LDH活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同質(zhì)量濃度MycP1作用后ANA-1活細(xì)胞數(shù)及培養(yǎng)上清中LDH活力比較

3 討論

該研究中，作者成功克隆、表達(dá)了結(jié)核分枝桿菌毒力株H37Rv的Rv3883c基因，獲得高純度的MycP1融合蛋白。LDH廣泛存在于生物細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受損傷或死亡時(shí)，可釋放到細(xì)胞外，使細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH活性升高，現(xiàn)在已成為公認(rèn)的反映細(xì)胞損傷的指標(biāo)［12］。該蛋白作用于ANA-1細(xì)胞后，細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)明顯下降，培養(yǎng)上清中LDH活力明顯升高，說(shuō)明ANA-1受損，LDH釋放增多。研究結(jié)果表明，成功制備了MycP1蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的MycP1蛋白對(duì)細(xì)胞具有毒性作用。這為進(jìn)一步研究該蛋白的功能及其在整個(gè)結(jié)核病中的致病作用奠定了基礎(chǔ)。

該實(shí)驗(yàn)在大腸桿菌內(nèi)融合表達(dá)Rv3883c編碼的MycP1蛋白。在之前的實(shí)驗(yàn)中，作者發(fā)現(xiàn)Rv3883c的N末端存在由21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列，影響了蛋白表達(dá)。因此在該研究中，作者將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)(IPTG終濃度為0.1 mmol/L)，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，表明該重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后能在大腸桿菌中表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量為74 000的融合蛋白，這可能與該基因信號(hào)肽序列的去除相關(guān)。

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Prokaryotic expression of MycP1 of Mycobacterium tuberculosis and its cytotoxicity to macrophages

HUANG Dandan，BAO Lang，YANG Xiaoling，DENG Yihao，LIAO Dan

Research Unit of Infection and Immunity，West China School of Preclinical and Forensic Medicine，Sichuan University，Chengdu 610041

Mycobacterium tuberculosis;MycP1;macrophage;cytotoxicity

Aim:To establish the prokaryotic expression system of MycP1 of Mycobacterium tuberculosis.Methods:Therecombinant plasmid of pGEX-4T-1-Rv3883c was constructed and expressed in E.coli BL21(DE3)，and then induced by IPTG.The product was identified by SDS-PAGE and Western blot and purified with GST-affinity chromatography.The purified protein was applied to mice macrophages ANA-1 cells，and the cytotoxicity was evaluated by detecting LDH activity in culture medium and XTT absorption.Results:The recombinant plasmid pGEX-4T-1-Rv3883c was constructed successfully，and the purified product could decrease XTT absorption(F=34.327，P＜0.001)，increase the level of LDH activity in culture medium of ANA-1 cells(F=336.720，P＜0.001).Conclusion:The prokaryotic expression system of MycP1 has been successfully constructed，and the targeted protein has a toxic effect on macrophages.

R378.91

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.04.004

*國(guó)家傳染病重大專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目 2008ZX10003-013;國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 30872257

(2011-12-27收稿 責(zé)任編輯王 曼)