人源化乙肝表面抗體重鏈克隆、表達(dá)及免疫學(xué)特性初步鑒定

王曄愷 周吉航 周世權(quán) 曾 芳 黃燕燕 劉曉光

血源性乙肝疫苗在我國(guó)經(jīng)數(shù)十年近億人次的接種，雖從總體來(lái)說(shuō)具有良好的安全性和免疫原性，但對(duì)小部分使用者如新生兒等群體仍存在異源性致敏的風(fēng)險(xiǎn)［1］。隨著DNA重組技術(shù)的進(jìn)展，出現(xiàn)了鼠單抗、小分子抗體等各種重組乙肝表面抗體，但與天然的人抗體分子相比，小分子抗體結(jié)構(gòu)不完整無(wú)法發(fā)揮Fc段介導(dǎo)的各種生物學(xué)效應(yīng)，而鼠單抗則不能完全消除抗體的異源性，親和力也低。因此，本研究針對(duì)以上的問(wèn)題，通過(guò)流式分選得到抗體分泌細(xì)胞(antibody-secreting cells，ASC)群，建立起一種利用單細(xì)胞RT-PCR克隆并表達(dá)得到能與乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)特異性結(jié)合的人源化乙肝表面抗體(hepatitis B surface antibody，HB-sAb)重鏈，為人源化、個(gè)體化的乙肝治療性抗體開(kāi)發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

對(duì)象與方法

1．研究對(duì)象:選取健康志愿者8名，無(wú)各種器質(zhì)性和免疫性疾病史，未接種過(guò)乙肝疫苗，乙肝三系各項(xiàng)檢測(cè)均為陰性(放射免疫法)，對(duì)志愿者注射乙肝疫苗(基礎(chǔ)免疫3針)，完成第3針注射后的第30日清晨各志愿者均空腹抽血20ml，以枸櫞酸鈉(1∶9)抗凝，每份樣本取2ml全血3000r/min離心取500μl血漿檢測(cè)其HBsAb濃度(放射免疫法)，篩選得到HB-sAb＞1000mIU/ml的樣本1份。

2．單細(xì)胞分選:將篩選出的HBsAb＞1000mIU/ml的血樣(放免儀器為雅培i2000型，乙肝三系定量檢測(cè)試劑盒為配套試劑)用 Ficoll液(CEDARLANE-H-CL5020)分離，吸取500μl單個(gè)核細(xì)胞層懸液，PBS洗滌3次，吸棄上清，加CD3-FITC、CD20-FITC、CD38-PE、CD27-PC5、CD19-APC 各 20 μl(貝克曼-庫(kù)爾特)，振蕩混勻，避光靜置20min后，加200μl PBS，標(biāo)本置流式細(xì)胞儀(BD FACSAria高速分選型)上，依次選取 R1→R2→R3門(mén)，得到 R1＆R2＆R3細(xì)胞群(CD19+/CD20-＆CD3-/CD27high/CD38high)，用調(diào)試用96孔板(Axygen公司)確定液滴中心位置，開(kāi)啟這群細(xì)胞的分選，每孔一個(gè)細(xì)胞，分選多板(圖1)。分選結(jié)束后加蓋并取出微孔板，顯微鏡(Olympus BX60)下計(jì)數(shù)并記錄有單個(gè)細(xì)胞的孔號(hào)。

3．乙肝表面抗體重鏈克隆:單細(xì)胞RT-PCR模板制備:在顯微鏡下觀察到有單個(gè)細(xì)胞的微孔中每孔加入1%的NP40(碧云天生物技術(shù)研究所)5μl，42℃孵育 20min，再加 AMV 0．5μl，45℃孵育45min，然后分兩等份，分別用于重鏈部分全長(zhǎng)片段和全長(zhǎng)片段的克隆。

采用巢式PCR克隆重鏈部分全長(zhǎng)片段:取單細(xì)胞RT-PCR模板，第1輪PCR加Access Quick Master mix(2×)(Promega 公司)12．5 μl，dNTPs(10mmol/L each)0．5μl，重鏈部分全長(zhǎng)片段5'-隨機(jī)引物(天根生化)和3'-外側(cè)引物(5'-aaggtgtgcacgccgctggt-3')各 0．5μl(終濃度為 0．6μmol/L)，加ddH2O 補(bǔ)足 25μl，PCR 條件為 95℃ 15min;95℃ 1min，55℃1min，72℃ 1min，30 個(gè)循環(huán);72℃ 10min;4℃ 5min。第 2 輪PCR加第一輪 PCR 產(chǎn)物 2μl為模板，2 ×PCR buffer12．5μl，重鏈部分片段5'-隨機(jī)引物和3'-內(nèi)側(cè)引物(5'-cggttcggggaagtagtcct-3')各 1μl(終濃度為 0．6μmol/L)，PCR 條件均為:95℃ 5min;95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 45s，35 個(gè)循環(huán);72℃5min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。

4．重鏈部分全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物純化和鑒定:產(chǎn)物切割，用DNA膠回收純化試劑盒(Promega公司)純化，克隆到T載體，挑取20個(gè)白斑搖菌，送至中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所測(cè)序。

5．重鏈全長(zhǎng)克隆:取“單細(xì)胞 RT-PCR 模板”5μl，重鏈全長(zhǎng)引物 5'端引物(5'-atcagatctatggctagt gggaggtgggc-3')0．5μl(終濃度為 1μmol/L)，3'端引物 0．5μl(5'-atcaagctttcatttacccggagaca ggga-3')(終濃度為 1μmol/L)，10 × buffer 5μl，dNTP(25mmol/L)2μl，LA taq 0．5 μl，補(bǔ) ddH2O 到 25μl。擴(kuò)增條件為 95℃ 5min;95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 2min，35 個(gè)循環(huán);72℃10min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0．8%瓊脂糖凝膠電泳。產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，雙酶切克隆到pEGF-N1成為pEGFP-IgG(H)質(zhì)粒，并送中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所測(cè)序驗(yàn)證。

6．pEGFP-IgG(H)轉(zhuǎn)染:pEGFP-IgG(H)質(zhì)粒經(jīng) LipofectAMINETM試劑盒(Life Technologies公司)轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞，培養(yǎng)72h，取上清4000r/min離心10min，棄沉淀。

7．IgG(H)結(jié)合特異性驗(yàn)證:HBsAg(北京生物制品研究所)用1×SDS稀釋到10μg/ml，用PCR儀煮沸10min變性，每孔10μl上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白(15%分離膠，5%濃縮膠)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(300mA，30min)，5%脫脂牛奶封閉非特異抗原2h，按照蛋白質(zhì)marker切割PVDF膜，并分別加入1∶50稀釋的上清，4℃過(guò)夜。PBS-T洗滌3次，每次10min。再分別加入1∶1000稀釋的羊抗人 IgG-HRP(Santa Cruz)，室溫震搖1h，PBS-T洗滌3次，每次15min。ECL系統(tǒng)顯色，凝膠成像儀(BIO-RADUniversal HoodⅡ型)下攝片，采用Quaintity one分析軟件進(jìn)行條帶分析。

8．IgG(H)親和力檢測(cè):親和力常數(shù)(ka)測(cè)定參照Batty飽和法［2］，將 HBsAg溶解在 5μg/ml的碳酸鈉緩沖液中，室溫包被在96孔板中過(guò)夜，PBS-T洗3次，將不同濃度IG(H)上清加到96孔板中，孵育1h，洗去后加HRP標(biāo)記羊抗人IgG二抗，TMB顯色試劑盒顯色后置酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)下讀取數(shù)據(jù)。

結(jié) 果

1．重鏈部分全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物電泳:條帶約在480bp左右，將其條帶回收后克隆到T載體(圖2)。

圖2 重鏈部分全長(zhǎng)電泳

2．重鏈部分全長(zhǎng)序列分析:20個(gè)白斑搖菌所得的20個(gè)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)Blast分析，15個(gè)克隆全長(zhǎng)在600bp～1kb，剩下的5個(gè)克隆中有3個(gè)是序列相同的克隆，另外2個(gè)也是IgG重鏈的序列，本研究中我們只選取了相同序列的3個(gè)克隆進(jìn)一步設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物擴(kuò)增其全長(zhǎng)。

3．重鏈全長(zhǎng) PCR產(chǎn)物電泳和測(cè)序:條帶約在1500bp左右，與預(yù)期長(zhǎng)度相符，經(jīng)測(cè)序分析重鏈全長(zhǎng)基因ORF序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的XP_002348298 95%同源，其Acession number為igg_heavy HQ829365(圖3)。

圖3 重鏈全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物電泳

4．IgG(H)結(jié)合特異性檢測(cè):Western blotting顯示，pEGFP-N1上清液孵和pEGFP-N1上清液加入10μgHBsAg后孵育均無(wú)目的條帶，而 pEGFP-IgG(H)上清液孵育有較強(qiáng)的條帶，但pEGFP-IgG(H)上清液加入10μgHBsAg后條帶灰度降低較大，這說(shuō)明上清液中加入的HBsAg與4d上的HBsAg競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合上清中的重鏈，從而造成4d上的條帶灰度降低(圖4)。

討 論

單克隆抗體自從20世紀(jì)70年代制備出來(lái)以后，在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、免疫學(xué)等諸多學(xué)科發(fā)揮了重要作用，在臨床上對(duì)于腫瘤等疾病也有一定的應(yīng)用價(jià)值［3］，但治療性單抗目前存在的主要問(wèn)題是多以鼠源為主，容易被人體免疫系統(tǒng)識(shí)別產(chǎn)生人抗鼠抗體而將其清除［4］。因此，單抗的人源化改造成為熱點(diǎn)，這是因?yàn)槿嗽椿脑旌蟛坏珳p少了機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)，而且人源化抗體中的Fc段能夠誘發(fā)機(jī)體效應(yīng)細(xì)胞的殺傷作用［5］。

目前完全人源化抗體的制備方法主要通過(guò)抗體庫(kù)技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，而我們通過(guò)流式分選和單細(xì)胞RT-PCR建立的這種從外周血ASC細(xì)胞中擴(kuò)增乙肝表面抗體重鏈基因的技術(shù)，不但達(dá)到了完全的人源化，而且從理論上說(shuō)可以針對(duì)個(gè)體制備出個(gè)體化的抗體，達(dá)到個(gè)體化治療的目的。由于ASC細(xì)胞目前的尚無(wú)共同認(rèn)可的表面標(biāo)記，Crotty等［6］認(rèn)為人記憶性B細(xì)胞表面標(biāo)記是CD19+CD20+Ig+CD27+，在受外界抗原刺激7天左右能達(dá)到外周血ASC細(xì)胞的2%左右，并通過(guò)酶聯(lián)斑點(diǎn)免疫法分離得到這群細(xì)胞。而本研究則采用Smith K等［7］報(bào)道所采用的 CD19+/CD20-＆CD3-/CD27high/CD38high這類(lèi)組合進(jìn)行篩選ASC細(xì)胞。并且單細(xì)胞RT-PCR的優(yōu)點(diǎn)在于克隆出來(lái)的重鏈和輕鏈和來(lái)源于同一ASC細(xì)胞，通過(guò)連接肽(Gly4Ser)3連接配對(duì)后，構(gòu)建出來(lái)的抗體可以和自然分泌抗體的分子結(jié)構(gòu)達(dá)到高度的相似性，從而最大程度地發(fā)揮抗體的結(jié)合能力，這是一般重組技術(shù)和多細(xì)胞模板的RT-PCR無(wú)法做到的。

抗體的免疫學(xué)特性主要體現(xiàn)于抗原抗體反應(yīng)的結(jié)合容量、親和力、特異性3方面，其中測(cè)定親和力Ka的方法有平衡透析法、Scatchard plot法和Batty飽和法等［8］，由于Batty飽和法簡(jiǎn)單適用，因此本研究用了此法檢測(cè)IgG(H)的Ka值達(dá)到了2．39×109L/mol，而根據(jù) James等［9］Ka為 107～1012L/mol為高親和力的理論，我們表達(dá)得到的IgG(H)親和力較高。在對(duì)抗體的特異性鑒定中一般使用交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，而本研究只通過(guò)設(shè)立多種對(duì)照初步地證明IgG(H)對(duì)HBsAg具有一定的結(jié)合力，提示此由此重鏈所制備得到的乙肝表面抗體非常可能具有清除乙肝病毒的能力，在職業(yè)暴露、產(chǎn)前阻斷等個(gè)體化預(yù)防和治療的應(yīng)用領(lǐng)域有廣泛的前景。

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7 Smith K，Garman L，Wrammert J，et al．Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen［J］．Nat Protoc，2009，4(3):372-384

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