腸道微生物與新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎

帥向華

新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是新生兒消化系統(tǒng)極為嚴(yán)重的疾病，有較高的發(fā)病率和病死率。臨床上以腹脹、嘔吐、腹瀉、便血、嚴(yán)重者發(fā)生休克及多系統(tǒng)器官功能衰竭為主要臨床表現(xiàn)，腹部X線檢查以腸壁囊樣積氣為特征。有報(bào)道，NEC的發(fā)病率大概在2% ～5%之間［1］。隨著新生兒學(xué)的發(fā)展，極低出生體重兒(VLBW)存活率不斷提高，NEC的發(fā)病率還在上升。NEC的病死率在10% ～50%之間，重度NEC的病死率接近100%。存活的NEC患兒常有長(zhǎng)期后遺癥，包括腸管狹窄、短腸綜合征、反復(fù)感染、體重不增和腦癱等［2］。由于NEC病死率高，長(zhǎng)期后遺癥重，從根本明確該病的發(fā)病機(jī)制顯得非常迫切與重要。

一、腸道微生物參與NEC發(fā)病的臨床證據(jù)

目前NEC的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，一般認(rèn)為是多因素綜合作用所致，包括低胎齡、低出生體重、低Apgar評(píng)分、透明膜病、配方奶喂養(yǎng)、臍靜脈插管和腸道缺血等［3］，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能不全或受損、細(xì)菌在腸腔內(nèi)過度繁殖并產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)，最終導(dǎo)致腸壁損傷甚至壞死、穿孔和全身炎癥反應(yīng)(SIRS)甚至休克、多器官衰竭。有數(shù)據(jù)顯示，預(yù)防性口服萬古霉素或慶大霉素可以減少NEC的發(fā)生率［4］。廣譜抗生素治療NEC及微生態(tài)制劑在臨床上應(yīng)用取得的良好效果，提示控制腸道微生物可以影響NEC患兒的預(yù)后［5］。從晚期NEC患兒的血、腹腔積液和大便中能分離出腸道細(xì)菌，包括大腸桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯桿菌屬等，偶有凝固酶陰性的葡萄球菌屬［6］。這些感染可能是由于細(xì)菌移位，即腸道原籍菌通過不成熟、受損的腸黏膜引起的。因此有學(xué)者推測(cè)，腸道微生物在NEC發(fā)病機(jī)制中起重要的作用。

二、腸道微生物參與NEC發(fā)病的作用機(jī)制

1．腸道微生物構(gòu)成腸黏膜的部分屏障功能:腸黏膜具有阻止病原微生物和抗原進(jìn)入體循環(huán)的屏障功能，包括外屏障功能和內(nèi)屏障功能［7］。胃酸、腸蠕動(dòng)、黏液層、分泌型免疫球蛋白A及正常腸道菌群等構(gòu)成了腸黏膜的外屏障功能，它抑制了病原微生物在腸道內(nèi)的定植和在腸上皮細(xì)胞上的黏附［8］。腸上皮細(xì)胞的半透膜和細(xì)胞間的緊密連接(TJs)等構(gòu)成了腸黏膜的內(nèi)屏障功能，又稱為細(xì)胞防御機(jī)制，它能阻止病原微生物通過和限制大分子物質(zhì)的彌散［9］。保持腸黏膜屏障功能的完整，才能保護(hù)機(jī)體免受病原微生物的侵害。

新生兒出生后就有細(xì)菌在腸道內(nèi)定植。新生兒和成人比較，腸道菌群有很大的不同。在新生兒，原籍菌在黏膜表面和腸腔內(nèi)的定植有一種特殊的方式，即所謂的“連續(xù)過程(succession)”［10］。它可分為 4個(gè)期，第Ⅰ期，也就是最初獲得期，從出生至生后2周，在這一期，鏈球菌和大腸桿菌在腸道內(nèi)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，革蘭陽性菌、無芽孢厭氧菌開始出現(xiàn)，包括母乳喂養(yǎng)的新生兒以雙歧桿菌占優(yōu)勢(shì)，配方奶喂養(yǎng)的新生兒以乳桿菌占優(yōu)勢(shì)，梭狀芽胞桿菌和類桿菌屬也能發(fā)現(xiàn)，但數(shù)量較少。第Ⅱ期發(fā)生于第Ⅰ期結(jié)束至開始消化固體食物之前，在這一期內(nèi)，類桿菌屬數(shù)量逐漸增加。第Ⅲ期發(fā)生于開始添加輔食至徹底斷母乳之前，這一期一直持續(xù)到腸道菌群與成人相似(第Ⅳ期)。腸道原籍菌、特別是厭氧菌，抑制了大腸菌的數(shù)量，使他們處于相對(duì)低的水平。實(shí)際上，細(xì)菌定植是NEC發(fā)病的前提條件［11］。在第Ⅰ期由于厭氧菌相對(duì)缺乏，使得病原微生物非常容易在新生兒消化道內(nèi)定植，從而促成了NEC的發(fā)病，所以在臨床上，NEC通常在生后2周左右發(fā)病。有研究顯示，共生菌不僅能調(diào)控某種保護(hù)基因的表達(dá)［12］，而且還能產(chǎn)生有毒物質(zhì)對(duì)抗需氧菌、競(jìng)爭(zhēng)占位效應(yīng)、降低腸腔內(nèi)pH值等，從而削弱病原微生物的黏附力，保護(hù)宿主。因此，正常的腸道菌群在整體上維持腸黏膜的屏障功能發(fā)揮了重要作用。

2．細(xì)菌在NEC發(fā)病中的分子學(xué)作用機(jī)制:病原微生物通過表面的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)與腸道的免疫系統(tǒng)發(fā)生相互作用。病原體相關(guān)分子模式是眾多微生物共有的一種保守的模式分子，它廣泛存在于病原體細(xì)胞表面，如脂多糖(LPS)、糖脂、鞭毛蛋白和核酸等。能識(shí)別PAMPs的受體稱為模式識(shí)別受體(pattern recognitionreceptor，PRRs)，它們與細(xì)菌PAMPs的相互作用，對(duì)保持腸壁完整性起關(guān)鍵作用。Toll－like受體(TLRs)是一個(gè)非常好的模式識(shí)別受體(PRRs)，至今已發(fā)現(xiàn)TLRs家族中的TLR1～10，其中，TLR－4已被廣泛研究，體內(nèi)與體外的NEC動(dòng)物試驗(yàn)研究，都證實(shí)LPS通過TLR－4結(jié)合進(jìn)行信號(hào)傳遞，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致 NEC癥狀的出現(xiàn)。Leaphart等［13］研究顯示 TLR－4增加了小鼠患 NEC的風(fēng)險(xiǎn)，從而證實(shí)了TLR－4信號(hào)的重要性。Caplan等［14］研究顯示母乳喂養(yǎng)動(dòng)物的腸上皮細(xì)胞上的TLR－4表達(dá)短暫下降，試驗(yàn)動(dòng)物的NEC發(fā)病率明顯下降。在NEC小鼠試驗(yàn)中，LPS濃度不僅在動(dòng)物血漿中，而且在大便樣本中都有升高［15］。與這些研究結(jié)果一致，LPS濃度在NEC患兒血漿中也明顯升高。因此LPS通過與TLR－4結(jié)合進(jìn)行信號(hào)傳遞是NEC發(fā)病機(jī)制中的重要分子學(xué)機(jī)制。

三、阪崎腸桿菌與NEC暴發(fā)

阪崎腸桿菌(enterobacter sakazakii，ES)是一種少見的微生物，它是革蘭染色陰性、無芽胞桿菌，以前被稱為黃色陰溝腸桿菌(yellow－pigmented Enterobacter cloacae)，1980年重新歸類為一種獨(dú)立的菌群。阪崎腸桿菌高度耐熱，并能耐受滲透壓和干燥，因此能在干燥的配方奶粉中存活。阪崎腸桿菌高度有毒，從0．36到66菌落形成單位/100克就足以引起疾?。?6］。阪崎腸桿菌與新生兒膿毒癥和腦膜炎有關(guān)，也與NEC的暴發(fā)有關(guān)。Van Acker等［17］曾報(bào)道，在NICU中的12例NEC患兒，ES是NEC暴發(fā)的病因。其中2例由于ES感染而死亡，并證實(shí)這些病例直接與使用被ES污染的配方奶粉有關(guān)，因此作者推薦在NICU中使用滅菌的液體牛奶來防止由于ES引起的NEC暴發(fā)。另外一個(gè)ES暴發(fā)發(fā)生在美國(guó)的孟菲斯市，包括4個(gè)新生兒，其中3個(gè)有膿毒癥和NEC相關(guān)的血樣便腹瀉，4個(gè)病例中培養(yǎng)出具有相同質(zhì)粒的ES，且追蹤到患兒曾使用同一罐奶粉［18］。這些報(bào)道均說明，細(xì)菌在NEC發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。絕大部分病原體通過有毒因子與特殊受體結(jié)合發(fā)揮對(duì)宿主的影響，如靶細(xì)胞表面的TLRs。通過NEC動(dòng)物模型研究，細(xì)菌黏附腸上皮是ES入侵腸黏膜的第一步。Hunter等顯示ES與小腸上皮細(xì)胞(IEC－6細(xì)胞)結(jié)合，導(dǎo)致小鼠上皮細(xì)胞凋亡，并引起炎癥因子上調(diào)，如IL－6等，從而引起試驗(yàn)小鼠的NEC臨床表現(xiàn)和形態(tài)學(xué)改變［19］。這種現(xiàn)象，在小鼠腸上皮細(xì)胞的體外試驗(yàn)中得到同樣的結(jié)果。因此可以證實(shí)，異常的細(xì)菌定植改變腸上皮細(xì)胞炎癥信號(hào)，從而影響腸上皮修復(fù)及腸上皮細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致臨床NEC．。

四、微生態(tài)制劑在治療和預(yù)防NEC中的作用

根據(jù)世界衛(wèi)生組織，微生態(tài)制劑是“活的微生物，當(dāng)給予足夠的數(shù)量時(shí)，對(duì)宿主的健康有利”［20］。應(yīng)用生態(tài)制劑主要是通過這些共生菌使嬰兒胃腸道菌群正?；?。這些保護(hù)性的細(xì)菌屬包括雙歧桿菌和乳桿菌。最常用的生態(tài)制劑包括多種類型的雙歧桿菌屬(bifidobacterium)，比如短雙歧桿菌(B．breve)和乳雙歧桿菌(B．lactis)，乳桿菌屬(lactobacillus)，如嗜酸乳桿菌(L．a(chǎn)cidophilus)和干酪乳桿菌(L．casei)，鏈球菌屬(streptococcus)，如唾液鏈球菌(S．salivaris)等［21］。

雙歧桿菌屬是最常用的微生態(tài)制劑，他們中的長(zhǎng)雙歧桿菌(B．longum)和兩歧雙歧桿菌(B．bifidum)通常發(fā)現(xiàn)于嬰兒時(shí)期的腸內(nèi)。也是母乳喂養(yǎng)的嬰兒腸腔內(nèi)能檢測(cè)到的最普遍的微生物。多種類型的雙歧桿菌對(duì)人體有益，比如刺激腸道淋巴組織分泌保護(hù)性因子，并抵抗病原微生物的定植。有些種屬的雙歧桿菌如動(dòng)物雙歧桿菌(B．a(chǎn)nimalis)和乳雙歧桿菌被應(yīng)用于奶制品、食物添加劑和藥物制劑中。微生態(tài)制劑對(duì)腸黏膜的保護(hù)作用，其機(jī)制還沒有被完全闡明，研究表明，應(yīng)用微生態(tài)制劑能保護(hù)早產(chǎn)兒腸道。一項(xiàng)有關(guān)微生態(tài)制劑在NEC中的應(yīng)用的多中心回顧性研究，包括近1500個(gè)新生兒，結(jié)果顯示腸道內(nèi)補(bǔ)充微生態(tài)制劑可以減少發(fā)生嚴(yán)重NEC的風(fēng)險(xiǎn)和早產(chǎn)兒的病死率。到目前為止，有4個(gè)關(guān)于在NICU患者中預(yù)防性使用微生態(tài)制劑的隨機(jī)對(duì)照研究。Hoyos等在1999年應(yīng)用嗜酸乳桿菌和嬰兒雙歧桿菌(bifidobacterium infantis)于NICU患兒中可以減少NEC的發(fā)病率和NEC相關(guān)的病死率，而沒有不良反應(yīng)。Bin－Nun等將嬰兒雙歧桿菌應(yīng)用于145個(gè)VLBW新生兒，結(jié)果顯示研究組NEC的發(fā)病率和NEC相關(guān)的死亡病例低于對(duì)照組，然而，膿毒癥的發(fā)生率和抗生素的應(yīng)用時(shí)間在研究組和對(duì)照組沒有區(qū)別。為了更好地闡明微生態(tài)制劑在NEC中發(fā)揮保護(hù)性作用的機(jī)制，許多的動(dòng)物研究正在進(jìn)行當(dāng)中。曾有研究顯示，給暴露于組織缺氧、配方奶喂養(yǎng)的新生小鼠口服嬰兒雙歧桿菌，結(jié)果顯示對(duì)腸道炎癥反應(yīng)有保護(hù)作用。最近的動(dòng)物試驗(yàn)研究顯示，預(yù)防性應(yīng)用保加利亞乳桿菌(lactobacillus bulgaricus)可以抑制細(xì)胞因子的上調(diào)，減少ES導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步推測(cè)，應(yīng)用保加利亞乳桿菌可以保護(hù)被ES污染配方奶喂養(yǎng)的幼鼠發(fā)展成NEC，因此生態(tài)制劑可能成為一種減少新生兒發(fā)生NEC發(fā)病率的一種預(yù)防性治療方法。

總之，NES是多因素作用的結(jié)果，病因復(fù)雜，最終通過腸黏膜屏障功能受損、從而細(xì)菌繁殖、入侵，釋放大量炎性介質(zhì)，導(dǎo)致NEC發(fā)病。人類胃腸道的微生態(tài)極其復(fù)雜，但隨著高通量(high－throughput)技術(shù)的進(jìn)步，腸道微生物促成NEC的發(fā)病機(jī)制研究將會(huì)有新的發(fā)現(xiàn)。由于新生兒腸道內(nèi)微生物缺乏多樣性，且容易控制，應(yīng)用宏基因組(metagenomics)等高通量技術(shù)研究新生兒腸道微生態(tài)，對(duì)有NEC高風(fēng)險(xiǎn)的極低出生體重兒(VLBW)的存活和預(yù)后有重大意義。將來更多的治療方法和預(yù)防策略將從NEC的發(fā)病機(jī)制上進(jìn)一步探索。

1 Weidmeier SE，Henry V，Baer VL，et al．Center differences in NEC within one health － care system may depend on feeding protocol［J］．Amer J Perinat，2008，25(1):5 －11

2 Blakely ML，Lally KP，McDonald S，et al．Postoperative outcomes of extremely low birth－weight infants with necrotizing enterocolitis or isolated intestinal perforation:aprospective cohort study by the NICHD Neonatal Research Network［J］．Ann Surg．2005，241(6):984 －994

3 Boccia D，Stofli I，Lana S，et al．Nosocomial necrotizing enterocolitis outbreaks:epidemiology and control measures［J］．Eur J Pediatr，2001，160(6):385 －391

4 Potoka DA，Nadler EP，Upperman JS，et al．Role of nitric oxide and peroxynitrite in gut barrier failure［J］．World J Surg，2002，26(7):806－811

5 Caplan MS．Probiotic and prebiotic supplementation for the prevention of neonatal necrotizing enterocolitis［J］．JPerinatol，2009，29 suppl 2:S2－S6

6 Potoka DA，Upperman JS，Nadler EP，et al．NF － kappaB inhibition enhances peroxynitrite － induced enterocyte apoptosis［J］．J Surg Res，2002，106(1):7 －14

7 Upperman JS．Glutathione(GSH)levels in necrotizing enterocolitis(NEC)［J］．J Pediatr Surg，2005，40(11):1813

8 Muller CA，Autenrieth IB，Peschel A．Innate defenses of the intestinal epithelial barrier［J］．Cell Mol Life Sci，2005，62(12):1297 － 1307

9 Artis D．Epithelial cell recognition of commensal bacteria and maintenance of immune homeostasis in the gut［J］．Nat Rev Immunol，2008，8(6):411－420

10 Uhlig HH，Powrie F．The role of mucosal T lymphocytes in regulating intestinal inflammation［J］．Springer Semin Immunopathol，2005，27(2):167－180

11 Podd BS，Thoits J，Whitley N，et al．T cells in cryptopatch aggregates share TCR gamma variable region junctional sequences with gamma delta T cells in the small intestinal epithelium of mice［J］．J Immunol，2006，176(11):6532 －6542

12 Hooper LV．Bacterial contributions to mammalian gut development［J］．Trends Microbiol，2004，12(3):129 －134

13 Leaphart CT，Cavallo J，Gribar SC，et al．A critical role for TLR 4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair［J］．J Immunol，2007，179(7):4808 － 4820

14 Caplan MS，Miller R，Kaup S，et al．Bifidobacterium supplementation reduces the incidence of encrotising enterocolitis in neonatal rat model［J］．Gastroenterology，1999，117(3):577 －583

15 Jilling T，Simon D，Lu J，et al．The role of bacteria and TLR4 in rat and murine models of necrotizing enterocolitis［J］．J Immunol，2006，177(5):3273－3282

16 Hunter CJ，Petrosyan M，F(xiàn)ord HR．Prasadarao NV．Enterobacter sakazakii:an emerging pathogen in infants and neonates［J］．Surg Infect，2008，9(5):533 －539

17 van Acker J，de Smet F，Muyldermans G，et al．Outbreak of necrotizing enterocolitis associated with enterobacter sakazakii in powdered milk formula［J］．JClin Microbiol，2001，39(1):293 － 297

18 Simmons BP，Gelfand MH，Metts L，et al．Enterobacter sakazakii infections in neonates associated with intrinsic contamination of powdered infant formula［J］．Infect Control Hosp Epidemiol，1989，10(9):389－401

19 Hunter CJ，Singamsetty VK，Chokshi NK，et al．Enterobacter sakazakii enhances epithelial cell injury by inducing apoptosis in a rat model of necrotizing enterocolitis［J］．JInfect Dis，2008198(4):586 － 593

20 Cabana MD，Shane AL，Cao C，et al．Probiotics in primary care pediatrics［J］．Clin Pediatr(Phila)，2006，45(5):405 －410

21 Bin－Nun A，Bromiker R，Wilschanski M，et al．Oral probiotics prevent necrotizing enterocolitis in very low birth weight infants［J］．JPediatr，2005，147(2):192 －196