干姜、大黃和丹參水提物對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的藥性學(xué)對比研究※

陳智偉 周紅祖 余惠旻*

（1 廣東省深圳市中醫(yī)院，深圳518020；2 深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院，深圳518060）

中藥四性即中藥的寒、熱、溫、涼四種功能之氣，是中醫(yī)藥最重要的基本理論之一。近年來，中藥四性理論的研究雖然取得一定進(jìn)展，對從現(xiàn)代科學(xué)視角認(rèn)知中藥四性理論起到一定作用，但從整體上看，研究成果仍不足以促使中藥四性理論體系產(chǎn)生質(zhì)的飛躍。

本課題組前期研究證明：中藥藥性不同，其抗凋亡作用亦不同[1-3]。來源和功效相同或相近的人參類中藥對細(xì)胞凋亡的作用存在很大的差異性[4-5]。西洋參（涼性）和紅參（溫性）水提物均對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡具有不同程度的保護(hù)作用[6]，而溫性中藥抗凋亡作用更強(qiáng)；來源和功效不同的中藥附子、黃芩和穿心蓮對MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的作用亦不同，附子（熱性）具有顯著的保護(hù)作用[7]。為了驗(yàn)證其他不同藥性的中藥也具有相同的作用趨勢，本研究運(yùn)用不同寒熱藥性的藥物——干姜（熱）、大黃（寒）和丹參（微寒），觀察其對MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的作用，以此為建立中藥四性的凋亡學(xué)模型奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 CO2培養(yǎng)箱（美國 Shella公司）；DC300型倒置熒光相差顯微鏡（德國Leica公司）；超凈工作臺(tái)（比利時(shí)Esco 公司）；Rotofix32型離心機(jī)（德國Hettich公司）；AllegraTM21R型低溫離心機(jī)（美國Coulter公司）；Epics XL型流式細(xì)胞儀（美國 Coulter公司）；Polar star Galaxy型酶標(biāo)儀（德國BMG公司）。

1.2 試藥 干姜、大黃、丹參均購于深圳華輝藥業(yè)有限公司，由深圳市中醫(yī)院中藥科劉志誠主任藥師鑒定為正品。MPP+、MTT、二甲基亞砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）、RNA酶（RNase）均購自美國 Sigma公司；1640培養(yǎng)基、胰酶（trypsin，美國Gibico公司）；胎牛血清（FBS，美國Hyclone公司）；Hoechst 33258（瑞士Fluka公司）。

1.3 細(xì)胞 SH-SY5Y細(xì)胞取自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 藥物制備

2.1.1 中藥（干姜、大黃、丹參）水提物的制備 取干姜、大黃、丹參中藥材各100g粉碎，加8倍蒸餾水浸泡0.5 h，水浴2h，紗布過濾，濾渣先后加6倍、4倍量水，各提0.5h。合并3次濾液，冷凍干燥，得到干姜、大黃、丹參凍干粉各12.24g、24.00g和41.70g。凍干粉溶于滅菌去離子水，12000r·min-1，離心 5min，上清液過 0.22μm的濾膜，配成 400mg·mL-1（生藥濃度）的母液，實(shí)驗(yàn)前用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度（終濃度以生藥濃度計(jì)）。

2.1.2 MPP+去離子水配制成80mmol·L-1的母液，-20℃保存。用時(shí)培養(yǎng)基稀釋成實(shí)驗(yàn)所需濃度。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與預(yù)處理 用含有體積分?jǐn)?shù)為 10 %的FBS，1%的非必須氨基酸（NEAA）的1640完全培養(yǎng)基，于37℃、5%的CO2孵箱中培養(yǎng)。4d進(jìn)行1次傳代，傳代時(shí)取0.2ml細(xì)胞懸液（密度為8×106·mL-1）加入到 9 mL 培養(yǎng)基中，取生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 將實(shí)驗(yàn)分為5組：即正常對照組、模型租和干姜、大黃、丹參水提物組。

2.4 觀察指標(biāo)和方法

2.4.1 顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) SH-SY5Y 以 7×104·ml-1密度接種于直徑為 6cm的培養(yǎng)皿，模型組用終濃度為0.5mmol·L-1的 MPP+作用 60h，干姜、大黃、丹參組分別用 5mg·mL-1和 10mg·Ml-1的水提物與 0.5mmol·L-1的MPP+共同孵育60h，每組均3個(gè)復(fù)孔，于倒置顯微鏡下觀察并攝片。

2.4.2 MTT法測定細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104·mL-1，以 100μL·孔-1接入96孔板，37℃、5%的CO2孵箱中培養(yǎng)48h。48h后吸棄舊培養(yǎng)基，正常對照組加入100μL的新鮮培養(yǎng)基，MPP+模型組加入100μL含有 MPP+的培養(yǎng)基，干姜、大黃和丹參水提物組分別加入 100μL含有 MPP+和不同濃度的干姜、大黃和丹參水提物的培養(yǎng)基，各濃度6個(gè)復(fù)孔。藥物作用60h后，每孔加5 mg·mL-1的MTT（PBS配）10μL，4h后，棄培養(yǎng)液，加DMSO 150μL·孔-1，輕輕震蕩10 min，使甲臢顆粒溶解，用酶標(biāo)儀在 570nm處讀取吸光度(OD)值，取 6孔均值按下列公式計(jì)算，細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值×100。各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4.3 Hoechst 33258染色形態(tài)學(xué)觀察 將 SH-SY5Y細(xì)胞（7×104·mL-1）接種于直徑為6cm的培養(yǎng)皿的蓋玻片上，各實(shí)驗(yàn)組按要求給予不同的處理因素后，加入新鮮配制的4%多聚甲醛（pH值為7.4）于37 ℃固定細(xì)胞30min，PBS液洗2次，加5mg·L-1Hochest 33258染色液染色30min，PBS液洗后，用封片液(20mmol· L-檸檬酸，50mmol·L-1磷酸氫二鈉，50%甘油，pH=5.5)封片后熒光顯微鏡觀察、攝片。

2.4.4 PI單染流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期

調(diào)整細(xì)胞密度為 7×104·mL-1，以 3mL·well-1種入直徑為6 cm的培養(yǎng)皿。分組和處理同上，每組6個(gè)復(fù)孔。藥物作用 60h后，細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，1000 r·min-1離心 10 min，去上清液，PBS漂洗 2次，沉淀中緩慢依次加入70%的冰乙醇固定。- 20℃固定24h。固定后，1000r·min-1離心10min，去上清液，PBS漂洗2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106·mL-1。加 RNase 至終濃度 100μg·mL-1，37℃水浴30min。加PI至終濃度50μg·mL-1，350目尼龍網(wǎng)濾膜過濾去除細(xì)胞團(tuán)塊，4℃避光染色30min后，上流式細(xì)胞儀檢測（激發(fā)波長：488nm；發(fā)射波長:610nm）各期細(xì)胞 DNA的含量。測定數(shù)據(jù)按流式細(xì)胞儀所配置的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以DNA組方圖出現(xiàn)低于G1期DNA含量的亞G1峰的大小代表凋亡細(xì)胞的數(shù)值。

2.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)采用 SPSS 1010 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 干姜、大黃、丹參水提物對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響 在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，傳代的SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)4 h左右貼壁，起初呈梭型或橢圓形，18 h后胞體出現(xiàn)樹枝狀突起（軸突），以后逐漸顯著，胞間的突起相互連接。而模型組細(xì)胞（0.5mmol的MPP+）胞漿黯淡，出現(xiàn)空泡和小斑點(diǎn)，軸突消失，細(xì)胞皺縮變圓。經(jīng)Hochest 33258熒光染色后，對照組細(xì)胞核呈現(xiàn)出低強(qiáng)度彌散均勻的藍(lán)色熒光，模型組細(xì)胞核出現(xiàn)亮藍(lán)色的典型凋亡小體，其細(xì)胞核顯著固縮、凝聚和碎裂，而干姜、大黃、丹參水提物與0.5mmol MPP+同時(shí)處理SHSY5Y 細(xì)胞后，干姜組 SH-SY5Y的細(xì)胞核與對照組SH-SY5Y的細(xì)胞核形態(tài)接近，大黃組和丹參組SH-SY5Y的細(xì)胞核與模型組SH-SY5Y的細(xì)胞核形態(tài)接近，說明：干姜水提物對 MPP+誘導(dǎo)的 SH-SY5Y細(xì)胞凋亡有顯著的保護(hù)作用，而大黃和丹參組對 MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡無保護(hù)作用。10mg·mL-1干姜、大黃、丹參水提物對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響見圖 1。

圖1 10mg·mL-1干姜、大黃和丹參水提物對細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響（×400）

2.1 MTT法檢測SH-SY5Y細(xì)胞存活率 如圖2所示，與正常對照組相比，MPP+模型組存活率顯著降低為（30.43±2.69）%（P＜0.01）。MPP+和 5mg·mL-1干姜、大黃、丹參同時(shí)孵育后，存活率分別為（48.70±1.56）%、（20.10±2.97）%、（27.15±2.14）%，與模型組比較，干姜組保護(hù)作用明顯（P＜0.01），而大黃、丹參沒有保護(hù)作用。當(dāng)干姜、大黃、丹參的生藥濃度為10mg·mL-1時(shí)，其存活率又分別為（54.70±2.40）%、（22.17±1.98）%、（29.20±1.15）%，與模型組比較，干姜組保護(hù)作用明顯（P＜0.01），而大黃、丹參組沒有保護(hù)作用。以上數(shù)據(jù)表明，熱性中藥干姜對 MPP+誘導(dǎo)的 SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡有明顯的保護(hù)作用，而寒性中藥大黃、丹參沒有保護(hù)作用。

圖2 5、10mg·mL-1干姜、大黃、丹參水提物對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

3.2 干姜、大黃、丹參水提物對 MPP+誘導(dǎo) SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果表明：正常對照組 SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡率為（1.87±1.14）% ，經(jīng)0.5mmol·L-1MPP-1處理60h后，其凋亡率增加到（40.52±1.68）%，與正常組相比有顯著性差異（P＜0.01)，5mg·mL-1和 10mg·mL-1干姜水提物能顯著對抗細(xì)胞凋亡，凋亡率分別下降到（19.06±3.01）% 和（16.20±2.44）%（P＜0.01 vs. model group）。而大黃和丹參水提物則對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡無保護(hù)作用。10mg·mL-1干姜、大黃和丹參水提物對 MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響見圖3。

圖3 10mg·mL-1干姜、大黃、丹參和Aβ25-35對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率的影響

4 討論

前期研究發(fā)現(xiàn)，盡管不同藥性的中藥對神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。ˋβ25-35、MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y的凋亡模型）的作用各不相同[1-6]，但其抗凋亡作用卻有相似的趨勢，溫性中藥顯示出明顯的抗凋亡趨勢。藥性與細(xì)胞凋亡之間是否存在一定的關(guān)系，并能藉此區(qū)別中藥的寒熱屬性，筆者為此開展了系列對比研究。本文選取來源、成分功效、藥性均不相同的藥物——干姜（熱）、大黃（寒）和丹參（微寒），觀察其對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的作用，開展其藥性差異的對比性研究。MTT檢測的結(jié)果顯示，干姜水提物對 0.5mmol·L-1MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y凋亡有顯著的保護(hù)作用，并隨著干姜水提物濃度的提高，保護(hù)作用增強(qiáng)，而大黃和丹參水提物組無保護(hù)作用；Hochest染色的結(jié)果顯示，干姜水提物組能改變由MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡特性，呈現(xiàn)出低強(qiáng)度彌散均勻的藍(lán)色熒光，使細(xì)胞核形態(tài)恢復(fù)至接近對照組的特征，而大黃組和丹參組無改變；流式細(xì)胞儀的結(jié)果進(jìn)一步顯示，干姜水提物能明顯的對抗由MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（P＜0.01），而大黃組、丹參組沒有保護(hù)作用。以上結(jié)果表明：熱性藥干姜對 MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用，對細(xì)胞的保護(hù)作用較強(qiáng)，而寒性藥大黃和丹參則無此作用。以上研究結(jié)果與前期的研究結(jié)果一致[3-7]，為以凋亡模型為基礎(chǔ)，建立中藥四性的凋亡學(xué)模式識(shí)別系統(tǒng)進(jìn)一步奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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