凹葉厚樸細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的研究※

段湘蘭 謝果珍 劉葉蔓.*

（1 湖南省農(nóng)科院職工醫(yī)院，長(zhǎng)沙410125；2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙410128）

凹葉厚樸 Magnolia officinalis Rehd. et Wils. Subsp.biloba(Rehd. et wils.)Law為木蘭科落葉喬木，其藥用有效成分主要為厚樸酚及和厚樸酚。凹葉厚樸在20a左右成材入藥。近年來，野生資源瀕臨枯竭，凹葉厚樸已被列為國家Ⅲ級(jí)保護(hù)植物。植物是重要的天然藥物資源，應(yīng)用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)可批量生產(chǎn)有用的植物藥物及其次生代謝物質(zhì)。通過細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)大量成分均一的植物細(xì)胞培養(yǎng)物，是解決藥用植物資源匱乏的理想途徑，這一技術(shù)，已成為繼微生物技術(shù)以后當(dāng)代生物技術(shù)重要的發(fā)展領(lǐng)域。而以培養(yǎng)藥用植物細(xì)胞直接生產(chǎn)天然藥物的研究又成為這一領(lǐng)域的新熱點(diǎn)[1-2]。本文作者前期對(duì)凹葉厚樸組織培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，在凹葉厚樸愈傷組織中，有效成分的含量甚微[3]，限制了凹葉厚樸的生物技術(shù)利用。本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上開展凹葉厚樸的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)及其生理特性研究，為建立凹葉厚樸高產(chǎn)細(xì)胞系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 以凹葉厚樸莖段誘導(dǎo)愈傷組織，繼代培養(yǎng)半年[3]，選擇質(zhì)地疏松、生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織作為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 種子細(xì)胞的培養(yǎng) 稱取愈傷組織4g，用鑷子夾碎接種于 100ml新鮮的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為B5+1.5 mg／L NAA+0.5mg／L 6-BA，蔗糖 20g/ L。培養(yǎng)8 d后，先用40目紗網(wǎng)過濾去除大的細(xì)胞團(tuán)，然后按1:3體積轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)液，繼代培養(yǎng)4d后，再用80目紗網(wǎng)過濾。將含較小細(xì)胞團(tuán)的濾液經(jīng)4次繼代培養(yǎng)后，獲得較均一的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物，以此作為懸浮培養(yǎng)的種子細(xì)胞。

1.2.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 選用L9（34）正交設(shè)計(jì)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)號(hào)分別考察IAA、NAA、6-BA和KT四個(gè)因素對(duì)凹葉厚樸細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，基本培養(yǎng)基為B5。因素水平見表1，按表2各實(shí)驗(yàn)號(hào)的搭配順序，取“1.2.1”中培養(yǎng)的細(xì)胞種子液，接種到表2培養(yǎng)基中，每瓶10ml，每隔4d按 1：3的體積更換新鮮培養(yǎng)液繼代1次，繼代培養(yǎng) 3次后，通過過濾的方法獲得培養(yǎng)細(xì)胞，測(cè)其細(xì)胞鮮重，每組重復(fù)3次，取平均值。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平表

1.2.3 不同初始接種量對(duì)凹葉厚樸細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 分別吸取“1.2.1”中的細(xì)胞種子液2、4、6、8、10ml接種到 B5+0.5mg／L IAA +0.1mg／L NAA+0.1mg／L6-BA+0.5mg／L KT，蔗糖20g／L的液體培養(yǎng)基中，研究不同初始接種量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

1.2.4 不同蔗糖濃度對(duì)凹葉厚樸細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 分別設(shè)置蔗糖濃度為 15、20、25、30、35、40g／L 6個(gè)水平，取“1.2.1”中細(xì)胞種子液 6ml接種到“1.2.3”液體培養(yǎng)基中，研究不同蔗糖濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

1.2.5 不同pH值對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 分別設(shè)置 pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0共 5個(gè)水平，培養(yǎng)基中蔗糖濃度為 20g／L，研究不同 pH值對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

1.3 培養(yǎng)條件 以上試驗(yàn)如無特殊說明，均采用 150ml三角瓶，裝液量 40ml，搖床轉(zhuǎn)速 120 r／min，pH 值 6.5，培養(yǎng)溫度（23±2）℃，黑暗條件下培養(yǎng)。鮮重的測(cè)定方法及培養(yǎng)周期均同1.2.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)凹葉厚樸懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 經(jīng)過3次繼代培養(yǎng)后，各組培養(yǎng)基中凹葉厚樸懸浮細(xì)胞均有較明顯增加，試驗(yàn)結(jié)果見表2，在9個(gè)試驗(yàn)號(hào)中，1和5號(hào)培養(yǎng)基中凹葉厚樸細(xì)胞增加比較多，8號(hào)培養(yǎng)基中凹葉厚樸細(xì)胞增加最多。同時(shí)，隨著細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞的聚集度也慢慢地提高，出現(xiàn)大顆粒細(xì)胞團(tuán)。極差分析表明，這4種因素對(duì)凹葉厚樸懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響程度依次為 6-BA＞NAA＞KT＞IAA，最優(yōu)組合是A3B2C1D3，即：B5+1.5mg／LIAA+0.3mg／LNAA +0.1mg／L6-BA +1.5mg／LKT。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 不同初始接種量對(duì)凹葉厚樸細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 接種量分別為2、4、6、8、10ml種子液，收獲的細(xì)胞鮮重分別為10.55g/L、13.43g/L、15.34g/L、22.30g/L、17.21g/L，結(jié)果表明，8ml接種量收獲的細(xì)胞最多，為 22.30g/L。低于這個(gè)接種量，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，當(dāng)接種量達(dá)到 10ml時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，但隨著細(xì)胞的迅速生長(zhǎng)，大顆粒細(xì)胞團(tuán)增加，細(xì)胞的生長(zhǎng)量反而較低。

2.3 不同蔗糖濃度對(duì)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 蔗糖對(duì)凹葉厚樸懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響隨著濃度的不同而表現(xiàn)出較大差異。蔗糖濃度為 15、20、25、30、35、40 g／L 6個(gè)水平的細(xì)胞收獲量分別為 11.53g/L、12.03g/L、14.34g/L、15.74g/L、13.70 g／L、11.25g／L。在蔗糖濃度 30g／L以下，細(xì)胞的生長(zhǎng)量隨蔗糖濃度的提高而增加，30g／L蔗糖對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響最大，細(xì)胞鮮重為15.74g／L，當(dāng)蔗糖濃度進(jìn)一步提高，細(xì)胞生長(zhǎng)量的積累則呈下降趨勢(shì)，細(xì)胞有褐化現(xiàn)象。

2.4 不同pH值對(duì)凹葉厚樸懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0共 5個(gè)水平，細(xì)胞收獲量分別為9.25g/L、11.34g/L、11.33g/L、17.65g/L、9.70 g／L。不同pH值對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響差異較大，pH值過低或過高都不利于凹葉厚樸細(xì)胞的生長(zhǎng)，在5個(gè)水平中pH值為6.5最適合細(xì)胞生長(zhǎng)。

3 討論

通過極差分析發(fā)現(xiàn)，四種激素對(duì)凹葉厚樸懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響程度依次為 6-BA＞NAA＞KT＞IAA，6-BA是影響凹葉厚樸懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的主要因素。作者在前期階段的試驗(yàn)中[3]，利用了比較高的6-BA濃度，并與NAA搭配使用，在凹葉厚樸懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中，這種協(xié)同作用的促進(jìn)依舊，同愈傷組織誘導(dǎo)一樣，效果較好。

許多植物細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，初始接種量對(duì)細(xì)胞的增殖有明顯的影響。植物細(xì)胞具有群集效應(yīng)，只有當(dāng)接種量達(dá)到一個(gè)臨界值時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)量才顯著增加。當(dāng)?shù)陀谶@臨界值時(shí)，生長(zhǎng)緩慢；高于臨界值時(shí)，由于細(xì)胞密度過大，分裂快，導(dǎo)致培養(yǎng)液中的養(yǎng)分很快被消耗殆盡，同時(shí)容易積累有害物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞衰老，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)量也會(huì)逐漸減少，本試驗(yàn)中最佳的接種量為8ml。

蔗糖是植物賴以生長(zhǎng)的重要碳源和滲透壓調(diào)節(jié)劑，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和形態(tài)的發(fā)生具有十分重要的作用。當(dāng)蔗糖濃度較低時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)量較小，主要受能源物質(zhì)和碳源供給的限制，此時(shí)滲透勢(shì)的調(diào)節(jié)則處于次要地位。隨蔗糖濃度的提高，能源物質(zhì)和碳源供給達(dá)到飽和，這時(shí)蔗糖濃度再進(jìn)一步提高，僅起到調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓的作用。高糖帶來的培養(yǎng)基高滲透壓不僅對(duì)其他營養(yǎng)物質(zhì)的吸收有抑制作用，還可造成細(xì)胞內(nèi)含水量下降，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。

筆者的研究結(jié)果表明，在pH值為6.5時(shí)，凹葉厚樸懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)量達(dá)到最大，在pH值為5.5和6.0時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)量基本相同，說明在一定范圍內(nèi)細(xì)胞具有一定的自身調(diào)節(jié)能力，但在pH值為7.0和5.0時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)量都很低。由此看來，凹葉厚樸的細(xì)胞生長(zhǎng)需要微酸性環(huán)境，在微酸性環(huán)境下，細(xì)胞對(duì)pH值有一定的調(diào)節(jié)作用，但超過這個(gè)范圍，pH值將會(huì)明顯的影響細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)。pH值對(duì)植物細(xì)胞的影響有很多方面，包括引起質(zhì)膜通透性變化，影響植物細(xì)胞對(duì)一些物質(zhì)的吸收以及植物細(xì)胞的代謝等。通過對(duì)其動(dòng)態(tài)變化的研究，可以人工添加適量酸堿值穩(wěn)定劑，使培養(yǎng)液pH值始終維持在有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的范圍內(nèi)，從而獲得更大生長(zhǎng)量。

[1]陳文源,呂一婷.藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)與新藥研發(fā)進(jìn)展(綜述)[J].亞熱帶植物科學(xué),2009,38(4):85-88.

[2]李冬杰,魏景芳,劉淑清.藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].河北林業(yè)科技,2003,8(4):22-23.

[3]劉葉蔓,趙碧清,曾婷.凹葉厚樸愈傷組織的誘導(dǎo)及其有效成分含量的比較[J].中國藥房,2008, 19(18):1393-1395.