聚乙二醇重組人粒細胞集落刺激因子注射液Ⅰ期臨床藥代動力學和藥效學研究

韓曉紅，張春玲，劉 鵬，宋媛媛，姚嘉瑞，秦 燕，唐 樂，張淑香，李 丹，馮 云，石遠凱

(北京協(xié)和醫(yī)學院中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所內(nèi)科，北京 100021)

化療是目前治療腫瘤的主要手段之一，但化療藥物造成的不良反應如骨髓抑制等不僅給患者增加了感染、出血等風險，同時還直接影響了化療的順利進行。

重組人粒細胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF)是一種防治腫瘤化放療引起的中性粒細胞減少癥的有效藥物，它與表達在中性粒細胞及其祖細胞表面的高親和性、特異性受體結(jié)合，促進粒細胞系的造血干細胞的分化和增殖，促進骨髓中成熟的中性粒細胞向外周血釋放，同時刺激造血干細胞向外周血釋放［1］。但因rhG-CSF易被酶水解和腎臟清除，在體內(nèi)半衰期短，需每日給藥，重復注射不僅增加了患者的痛苦，也會引起一些不良反應。目前，為了解決這些問題，降低酶解機會，增加穩(wěn)定性，延長血漿消除半衰期，減小血藥濃度波動，許多藥品研究機構(gòu)進行了大量長效rhG-CSF制劑的研究，部分制劑已上市，如美國Amgen公司生產(chǎn)的PEG-rhG-CSF(商品名Neulasta)。

北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司研發(fā)的PEG-rhGCSF制劑，通過基因重組技術(shù)在大腸埃希菌表達并純化rhG-CSF，以分子質(zhì)量為20 ku的PEG共價修飾后制成制劑。經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(臨床研究批件號:2009L01505)，在中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院開展Ⅰ期臨床研究。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器 聚乙二醇重組人粒細胞集落刺激因子注射液(PEG-rhG-CSF，規(guī)格:1.0 g·L－1/支，批號:20090401，由北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司研制)，重組人粒細胞集落刺激因子注射液(rhG-CSF，規(guī)格:150 mg·L－1/支，北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))。Human G-CSF ELISA試劑盒，美國R＆D Systems。超純水處理系統(tǒng)(型號:MILLIQ)，美國密理博公司;酶標儀(型號:680型)，美國伯樂公司;血細胞分析儀(型號:XT-1800i)，日本希森美康;流式細胞儀(型號:FACSCalibur)，美國BD公司;全自動生化分析儀(型號:Modular P-800)，瑞士羅氏公司。

1.2 受試患者入選標準 經(jīng)病理組織學或細胞學確診的腫瘤患者;KPS評分≥60，年齡18～75歲，男女不限，預計生存期3個月以上;既往未接受過放療、化療;骨髓造血功能正常(骨髓穿刺細胞學檢查示骨髓增生活躍，且未見惡性腫瘤細胞浸潤);外周血常規(guī)正常，無出血傾向;無明顯心功能障礙或代謝性疾病，肝功能指標AST、ALT、總膽紅素均在正常上限的2.5倍以內(nèi)，肌酐、尿素氮均在正常上限的1.5～2倍以內(nèi)，自愿受試并簽署知情同意書;能遵守試驗用藥及血液樣品采集規(guī)程。

臨床試驗方案、臨床病例報告表、知情同意書等均取得中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院GCP中心倫理委員會審批并備案。

1.3 受試者一般情況 入組受試患者共24例，其中14例男性，10例女性，中位年齡為57歲(34歲～69歲)，23例非小細胞肺癌患者，1例鼻咽癌患者(Tab 1)。

Tab 1Patient characteristics by dosage group(±s，n=8)

Tab 1Patient characteristics by dosage group(±s，n=8)

Characteristic Group 60 μg·kg－1100 μg·kg－1150 μg·kg －1 Sex Male 5 5 4 Female 3 3 4 Age(years)Mean 54.3 52.8 59.1 Median 57.5 52.5 58 SD 7.1 9.9 4.5 Range 41～62 34～69 53～67 Baseline ANC(×109cells·L－1)Mean 5.66 4.75 5.30 Median 5.55 4.76 5.20 SD 1.5 1.4 1.7 Range 3.69 ～8.1 2.69 ～7.36 2.95 ～8.01 Cancer type Non-small cell lung cancer 7 8 8 Nasopharyngeal cancer 1 0 0

1.4 試驗設(shè)計 本研究為單中心、開放性劑量遞增的Ⅰ期臨床試驗，受試患者均采用以卡鉑和紫杉醇為基礎(chǔ)的2個周期化療方案，用藥劑量分別為紫杉醇175 mg/m2，化療周期 d 1靜脈輸注3 h，卡鉑AUC 5化療周期d 1靜脈輸注30 min，21 d為一周期，兩個化療周期用藥劑量和時間相同。

第1周期化療時不用PEG-rhG-CSF或其它升白細胞藥物，但當 ANC＜0.5×109cells·L－1或ANC ＜1.0×109cells·L－1且伴有發(fā)熱時，每日1次皮下注射rhG-CSF 150 μg，至連續(xù)2次外周血白細胞數(shù)(WBC)≥10×109cells·L－1或 ANC≥5.0×109cells·L－1時停止給藥。

第2周期在化療藥物給藥結(jié)束后48 h皮下注射PEG-rhG-CSF 1次，參照費氏遞增法，遞增劑量分別為60、100、150 μg·kg－13 個劑量組(每一劑量組受試患者8例，同一受試患者不進行重復試驗，從小劑量開始，每個劑量觀察結(jié)束后，才可進行下一劑量。不可同時進行2個以上劑量組的試驗。如出現(xiàn)重度不良反應或半數(shù)以上受試者出現(xiàn)中度不良反應，即使未達到最大劑量，均停止試驗)。

1.5 樣本采集

1.5.1 PEG-rhG-CSF血藥濃度監(jiān)測 分別于PEG-rhG-CSF 給藥前 3 0 min(0 h)、給藥后2、4、8、12、16、24、36、48、72、96、144、216、288、360、432 h 于靜脈采血并分離血清，于－80℃冰箱保存，備測。

1.5.2 血常規(guī)及CD34+檢查 血細胞分析儀測定血常規(guī)，流式細胞儀檢測CD34+細胞，第一周期化療期間從化療d 2起隔日檢查血常規(guī)，直到化療周期的d 20結(jié)束。第2周期化療期間從化療d 2起每日定時檢查血常規(guī)(含ANC)及CD34+細胞，至d 14(其中d 3注射PEG-rhG-CSF后12 h加測一次血常規(guī)及CD34+細胞)，以后隔日檢查一次直到化療周期的d 20結(jié)束。

1.5.3 血清生化指標檢查 兩個化療周期的給藥前、化療周期中d 8、15利用全自動生化分析儀分別檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、總膽紅素、血糖、尿素氮、血清肌酐、β2微球蛋白等血清生化指標。

1.6 血藥濃度測定 使用Human G-CSF檢測試劑盒，按試劑盒說明書操作步驟，進行血清中rhG-CSF濃度檢測。

1.7 數(shù)據(jù)處理及分析 用Microcal origin 8.0軟件以四參數(shù)方程擬合標準曲線，WinNonlin 5.2.1軟件進行藥代動力學參數(shù)分析，并計算AUC0-t、CL_F等參數(shù)，Excel for Windows(2007版，微軟公司)進行數(shù)據(jù)處理，實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，利用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 方法學研究 本方法的準確度和精密度良好，均符合生物樣品的測定要求，用試劑盒定量檢測血清中的 P EG-rhG-CSF濃度，經(jīng)試驗驗證，在39～2 500 ng·L－1范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性。標準曲線用四參數(shù)方程進行擬合，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。本試驗最低定量限為標準曲線的最低濃度，即39 ng·L－1。方法學考察結(jié)果顯示，日內(nèi)精密度(RSD%)為4.3% ～6.8%，日間精密度(RSD%)為 4 .7% ～13.3%，準確度(RE%)為 －5.0% ～2.7% 。同時驗證了血清樣本在室溫放置2 h及－20℃放置8周穩(wěn)定性均良好。血清樣品的稀釋因子范圍為5～300。用6個健康人的空白血清配制與質(zhì)控樣品相同濃度的高、中、低3個濃度樣品，每個濃度進行3個平行樣品考察是否存在基質(zhì)效應，結(jié)果顯示低濃度點 RE%小于20%，中、高濃度點 RE%均小于15%。另外該試劑盒與IL-2、IL-3、GM-CSF、IFN-γ、TNF-α等多種細胞因子均無明顯交叉反應。

2.2 血藥物濃度測定結(jié)果 測定各劑量組不同采血時間點血清中藥物濃度，繪制平均血藥濃度－時間曲線(Fig 1)。

Fig 1 The concentration-time curve of subjects after injecting different doses of PEG-rhG-CSF(±s)

2.3 藥代動力學研究 藥代動力學研究結(jié)果(Tab 2)，將3個劑量組間Tmax、T12進行比較，低、中劑量組差異不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，低、中劑量組與高劑量間差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。提示給藥劑量 ＜ 100 μg·kg－1，吸收速率和半衰期并未受到給藥劑量的影響，但當給藥劑量 ＞ 100 μg·kg－1，可能是由于給藥部位及體內(nèi)的受體達到局部飽和狀態(tài)，導致吸收速率和半衰期延長。3個劑量組間Vz_F差異較小(0.935～0.821 ml·g－1)(P＞0.05)，提示表觀分布容積并未受給藥劑量影響;3個劑量組間 A UC0-t，Cmax，CL_F 比較，低、中、高劑量差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，隨著給藥劑量的增加，AUC0-t增加，Cmax增加，CL_F 降低，提示藥物在體內(nèi)存在一定的蓄積，在當前給藥劑量范圍內(nèi)，PEG-rhG-CSF在體內(nèi)呈現(xiàn)非線性的藥代動力學特征。

2.4 藥效學研究

2.4.1 兩個周期中ANC動態(tài)變化 rhG-CSF是防治腫瘤化放療引起的中性粒細胞減少癥的有效藥物，通過檢測患者外周血中性粒細胞絕對計數(shù)(ANC)可以初步判斷其療效。觀察各劑量組第1周期ANC變化(Fig 2)，第1周期3個劑量組ANC第1峰值均值分別為(9.0±5)、(12.7±3)、(5.8±1)×109cells·L－1，ANC 最 低點均值分別為(1.0 ±1)、(0.7 ±0.1)、(1 ±1)×109cells·L－1，最低點時間為13、11、15 d，在60 μg·kg－1劑量組有3 位患者在化療過程中出現(xiàn)Ⅳ度骨髓抑制，注射了rhG-CSF，故ANC呈現(xiàn)雙峰變化。

Tab 2Pharmacokinetic parameters of PEG-rhG-CSF(±s)

Tab 2Pharmacokinetic parameters of PEG-rhG-CSF(±s)

Parameter Group 60 μg·kg－1 100 μg·kg－1150 μg·kg －1 T 12/h 37.5 ±7 40.8 ±12 80.7 ±48 Tmax/h 16±10 23±7 33±8 Cmax/mg·L－1 112.41 ±61 199.49 ±75 371.5 ±145 AUC0-t/mg·h·L －1 5，593.6 ±5，435 14，651.3±12，183 23，002.5 ±6，655 Vz_F/ml·g－1 0.935 ±0.634 0.576 ±0.327 0.821 ±0.576 CL_F/μl·h－1·g－117±9 9±4 7±2

Fig 2 The contrast of ANC among different drug dose groups in the 1st chemotherapy cycle(±s)

各劑量組第2周ANC均呈現(xiàn)雙峰變化(Fig 3)，3個劑量組ANC第1峰值分別為(35.0±10)、(25.2±5)、(27.4 ±11)×109cells·L－1，3 個劑量組的ANC均值最低點依次為(1.9±1)、(2.3±2)、(6.6 ±5)×109cells·L－1，最低點時間點為 7、7、2 d，第2峰值分別為(7.8±3)、(11.0±3)、(16.7±9)×109cells·L－1。隨著給藥劑量的提高，ANC最低值、第2峰的峰值均有增高趨勢，各劑量組的ANC的變化與PEG-rhG-CSF呈現(xiàn)一定程度的量效關(guān)系。

對比第1周期和第2周期的ANC平均值，第2周期的第1峰值、最低值均高于第1周期，ANC最低值出現(xiàn)時間前移。

2.4.2 藥代動力學和藥效學聯(lián)合分析 第2周期各劑量組ANC與血藥濃度的動態(tài)變化擬合圖顯示(Fig 4)，以100 μg·kg－1為例，該劑量組 ANC 在化療周期的d3起開始下降，到d7降到最低點，期間PEG-rhG-CSF于d 3達到峰值，隨后開始緩慢下降;在d 7～10之間ANC持續(xù)上升，d 10達第2峰，此后ANC數(shù)值維持在一個較高的水平，此時PEG-rhG-CSF的血藥濃度開始迅速下降。血藥濃度變化與ANC值呈現(xiàn)相關(guān)性，且藥效峰值的出現(xiàn)時間滯后于血藥濃度峰值出現(xiàn)的時間，藥物的效應與血藥濃度存在一定的滯后性。

Fig 3 The contrast of ANC among different drug dose groups in the 2nd chemotherapy cycle(±s)

Fig 4 The relationship of ANC and serum drug concentration among different drug dose groups(±s)

2.4.3 外周血CD34+細胞數(shù)量的變化 應激、內(nèi)毒素、劇烈運動、化療和細胞因子(G-CSF、GM-CSF等)可明顯增加外周血中造血干細胞數(shù)，目前以細胞因子(G-CSF、GM-CSF)動員居多，同時動態(tài)檢測動員后外周血中CD34+細胞的含量可確定采集最佳時機。本實驗通過觀察PEG-rhG-CSF對外周CD34+細胞數(shù)量的影響，觀察其對造血干細胞的動員作用(Fig 5)，在第2周期化療中，發(fā)現(xiàn)3個劑量組的平均CD34+細胞達峰中位時間為d 9(9～10 d)，峰值分別為(19.7±14.2)、(30.8±15.0)和(27.6±21.2)×106cells·L－1，3 個劑量組 CD34+細胞均增高，但從變化趨勢來看，組間的量效關(guān)系并不明顯。

Fig 5 The cell numbers of peripheral blood CD34+cell among different drug dose groups(±s)

2.4.4 兩個周期血清生化指標的變化 觀察PEG-rhG-CSF的使用是否對生化指標有影響。根據(jù)檢測結(jié)果，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，比較不同劑量組在化療的不同時間，差異均沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

3 討論

rhG-CSF目前已廣泛應用于臨床治療各種原因引起的中性粒細胞減少癥［2－3］，同時還用于造血干細胞移植的干細胞動員與移植后造血功能重建等。但rhG-CSF半衰期短，需要頻繁給藥，易引起不良反應，增加了患者的痛苦。PEG化的rhG-CSF分子量增大，穩(wěn)定性提高，清除率減慢，半衰期延長，作用更為持久，減少了給藥次數(shù)，減輕了患者的痛苦。

rhG-CSF在體內(nèi)可以通過腎臟和中性粒細胞介導的兩種途徑清除，但PEG-rhG-CSF分子量增大，腎小球濾過減少，中性粒細胞介導清除占主導地位［4－9］。當ANC降低時，中性粒細胞介導清除過程減緩，藥物在體內(nèi)蓄積，PEG-rhG-CSF血藥濃度開始上升，使ANC增高;而當ANC增高時，中性粒細胞介導清除過程加快，血藥濃度迅速下降，ANC值維持在基線水平之上。這種自我調(diào)節(jié)大大提高了PEG-rhG-CSF在使用上的安全性。

本研究中PEG-rhG-CSF在低劑量組的平均半衰期為 37.5 h，平均清除率為 17 μl·h－1·g－1，與文獻報道的rhG-CSF半衰期3.37～3.5 h，清除率30 ～ 39.6 μl·h－1·g－1［6，8］相比，PEG-rhG-CSF 的半衰期明顯延長，清除速率明顯減慢。同時發(fā)現(xiàn)在第1周期化療過程中，受試患者均在不同程度上出現(xiàn)了骨髓抑制現(xiàn)象，其中60 μg·kg－1劑量組有3位患者在化療過程中出現(xiàn)Ⅳ度骨髓抑制，在第2周期給予受試藥物后，無1例病人出現(xiàn)骨髓抑制現(xiàn)象，且ANC最低值出現(xiàn)時間前移，ANC最低值提高，1次注射后無重復注射，同時該PEG-rhG-CSF(100 μg·kg－1)單次注射療效與 filgrastim(5 μg·kg－1·d－1)多次給藥的療效［5］相當。本研究表明PEG-rhG-CSF的使用維持藥效時間長、減少患者給藥次數(shù)、降低化療后出現(xiàn)Ⅳ度骨髓抑制的發(fā)生率。結(jié)合血藥濃度、ANC變化及臨床治療需要，本研究確定100 μg·kg－1為Ⅱ期臨床研究的推薦劑量。

與其他PEG化的制劑相比較，本研究的100 μg·kg－1劑量組消除相半衰期為40.8 h、平均清除率為 9 μl·h－1·g－1，而國外臨床研究中 PEG-rhGCSF 100 μg·kg－1劑量組的清除半衰期為 40.7 h，平均清除率為 12.3 μl·h－1·g－1［7］，本實驗 PEG-rhG-CSF半衰期稍有延長，清除率降低明顯。同時還發(fā)現(xiàn)，本研究中給予PEG-rhG-CSF后，隨著給藥劑量的提高，ANC最低值、第2峰的峰值均有增高趨勢，各劑量組ANC的變化與PEG-rhG-CSF呈現(xiàn)一定程度的量效關(guān)系，但在國外臨床研究中［7］，ANC的變化與PEG-rhG-CSF并沒有量效關(guān)系，這可能是由于本研究中患者既往未接受過放、化療，給予兩個周期相同的化療藥物和化療劑量，而國外臨床研究的患者給予的化療方案和化療劑量各不相同，導致了治療反應性的差異，影響了實驗的結(jié)果。

另外，本研究考察了PEG-rhG-CSF用于腫瘤患者自體外周血干細胞動員的可行性，PEG-rhG-CSF對外周血CD34+細胞動員效果存在明顯的個體差異，化療后動員的 CD34+細胞以 100 μg·kg－1劑量組動員最高，150 μg·kg－1劑量組動員效果與國外研究中 300 μg·kg－1劑量組接近［6］，同時 PEG-rhGCSF與外周血干細胞動員不具有量效關(guān)系。因此PEG-rhG-CSF是否適用于腫瘤患者外周血干細胞動員及其最適劑量仍有待研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，PEG-rhG-CSF的效應與血藥濃度存在一定的滯后現(xiàn)象，有研究報道，血液通常不是藥物的直接作用部位，而直接靶標是效應部位，通常指受體、酶和細胞膜等特異性超微結(jié)構(gòu)，所以大多數(shù)藥物效應的變化滯后于血藥濃度的變化［11－12］，基于這種變化已有研究者將PK/PD結(jié)合模型運用于PEG-rhG-CSF［13］和 rh-GSF［14］的研究，將劑量－濃度－效應關(guān)系進行估算，該模型能很好的反映藥物與受體結(jié)合及藥物從體內(nèi)清除的過程，從而能夠解釋效應與血藥濃度滯后的原因，因此PK/PD結(jié)合模型在Ⅰ期臨床研究中的意義有待研究。在今后國內(nèi)的臨床研究中，我們應積極將PK/PD結(jié)合模型運用在藥物臨床研究方案中，加速藥物開發(fā)進程。

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