鉤藤提取物抑制血管緊張素Ⅱ誘導血管成纖維細胞增殖及膠原合成的研究

姜月華，李運倫，任崇靜，劉 倩

(1.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟 南 250011;2.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355)

血管成纖維細胞(vascular adventitial fibroblasts，VAF)增殖、血管壁膠原沉積所致的血管重塑是高血壓病的重要病理變化，也是高血壓維持、惡化的結構基礎，尋找既可降壓又能抑制VAF增殖和膠原合成的藥物，是預防高血壓靶器官損害的重要策略。鉤藤是茜草科鉤藤屬植物，為中醫(yī)傳統(tǒng)常用藥，性涼、味甘苦，具有清熱平肝、息風定驚之功能，而鉤藤堿(Rhynchophylline)和異鉤藤堿(Isorhynchophylline)是從中藥材鉤藤中分離、提純的生物堿，前期研究表明鉤藤堿和異鉤藤堿具有降血壓、抗心肌重構、腦缺血保護、抗血管平滑肌細胞增殖等藥理效應［1－5］。但鉤藤堿和異鉤藤堿能否抑制血管緊張素Ⅱ(angiotensionⅡ，AngⅡ)誘導VAF增殖、凋亡及膠原合成尚不清楚。本研究建立AngⅡ誘導VAF增殖模型，以鉤藤堿和異鉤藤堿為干預因素，探討其對AngⅡ促VAF增殖、膠原合成作用的影響，并探討其可能存在的抑制VAF增殖和膠原合成的分子機制，從而為鉤藤堿和異鉤藤堿的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 5～6周齡、♂ Wistar大鼠，購自山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.1.2 實驗藥品 鉤藤堿、異鉤藤堿和鉤藤總生物堿:由山東中醫(yī)藥大學藥學院周洪雷教授惠贈，用DMEM/F12培養(yǎng)基溶解、過濾除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆??？ㄍ衅绽?濟南東風制藥有限公司產(chǎn)品，用DMEM/F12培養(yǎng)基溶解、過濾除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑 DMEM/F-12培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品。胎牛血清(FBS)，四季青生物工程公司產(chǎn)品。AngⅡ，Sigma公司產(chǎn)品。Annexin V-FITC apoptosis detection kit，美國 BD Pharmingen公司產(chǎn)品。碘化丙啶(propidium iodide，PI)，美國 Oncogene公司;RNA酶，Sigma公司;胰蛋白酶粉(Trypsin)、谷氨酰胺(L-Glutamine)、DMSO、MTT，Amresco公司產(chǎn)品;臺盼藍，華美生物工程公司;波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體、α-肌動蛋白(α-actin)單克隆抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒，均為武漢博士德生物工程有限公司;c-myc鼠單抗IgG、熒光素標記抗體羊抗小鼠IgG SP檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒，均為北京中杉金橋生物技術有限公司產(chǎn)品。BCA法蛋白定量試劑盒，北京百泰克生物技術有限公司產(chǎn)品。Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的引物由上海生工生物工程公司合成。其余常規(guī)生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 實驗儀器 ELx808全自動酶標儀，美國Biotek公司產(chǎn)品;FACSCalibur流式細胞儀，美國BD公司產(chǎn)品;BB16uV/BB5060uV CO2培養(yǎng)箱，Heraeus公司產(chǎn)品;超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司產(chǎn)品;Axiovert 40倒置相差顯微鏡，德國蔡司公司產(chǎn)品;Veriti 96孔型梯度PCR儀，美國ABI公司產(chǎn)品;S-570掃描電鏡，Hitachi(Japan)產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組 采用組織貼塊法培養(yǎng)大鼠胸主動脈成纖維細胞，胰蛋白酶消化法作傳代培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察并作成纖維細胞特異性Vimentin和α-actin免疫組化染色進行鑒定，選用3-8代VAF用于實驗。調(diào)整細胞密度為1×105·L－1，接種于培養(yǎng)板/瓶備用。細胞貼壁后，以AngⅡ模擬高血壓狀態(tài)造模，前期經(jīng)MTT法篩選，AngⅡ的最佳濃度為2×10－7mol·L－1。經(jīng)48 h預培養(yǎng)和24 h無血清培養(yǎng)基預處理后，隨機分組。① 正常組:不加特殊處理因素;② AngⅡ誘導增殖組:AngⅡ2×10－7mol·L－1;③ 卡托普利組:AngⅡ 2×10－7mol·L－1+400 mg·L－1卡托普利;④ 鉤藤總生物堿組:Ang Ⅱ 2×10－7mol·L－1+200 mg·L－1鉤藤總生物堿;⑤異鉤藤堿組:AngⅡ2×10－7mol·L－1+30 mg·L－1異鉤藤堿;⑥ 鉤藤堿組:2×AngⅡ 10－7mol·L－1+30 mg·L－1鉤藤堿。繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，進行實驗檢測。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞增殖活性的測定 MTT法。制備VAF懸液，以4×104·L－1濃度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μl。同上培養(yǎng)和分組，每組設6個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)44 h，每孔加入20 ml MTT(5 g·L－1)，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加入DMSO 150 ml，震蕩、混勻后于酶標儀490 nm波長下測吸光度(OD)，細胞增殖活性以OD值來表示。

1.3.2 細胞超微結構的觀察 同上培養(yǎng)和分組干預后，2.5%戊二醛固定12～24 h;經(jīng)0.1 mol·L－1磷酸緩沖液清洗2 h以上，中間換2～3次新液;用1%鋨酸固定1～1.5 h，用雙蒸水清洗2 h，中間換2～3次新液;梯度酒精(50%、70%、80%、90%、100%兩次)脫水，各20 min;醋酸異戊酯置換;常規(guī)臨界點干燥;粘托后用IB-5離子濺射儀鍍鉑;掃描電鏡觀察。

1.3.3 細胞周期的測定 同上培養(yǎng)和分組干預后，加入 RNA 酶25 μl，混勻，37℃水浴30 min;加入4℃PBS 2 ml，1 000×g離心10 min，棄上清;加 PI染液0.5 ml，室溫避光10 min，上流式細胞儀，每個樣本檢測10 000個細胞，分析細胞周期各時相所占的比率。

1.3.4 細胞 c-myc蛋白的測定 制備VAF懸液，以5×105·L－1濃度接種于已置入無菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，每孔2 ml，同上培養(yǎng)和分組，每組設6復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后按S-P試劑盒說明書進行操作，并略加修正。其步驟如下:①4%多聚甲醛固定30 min;② 水洗，3%H2O2去離子水室溫孵育5 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性;③正常羊血清封閉，室溫10 min，勿洗;④ 滴加鼠抗人c-myc一抗(1∶100稀釋)，濕盒，4℃過夜;⑤ 玻片復溫1 h至室溫，PBS沖洗;⑥ 滴加生物素化山羊抗鼠IgG，37℃10 min，PBS沖洗;⑦ 加入SP工作液，37℃ 10 min，PBS沖洗;⑧ 滴加DAB工作液，顯微鏡下觀察，至陽性顯色明顯時用自來水沖洗，終止顯色;⑨ 逐級脫水、透明，中性樹膠封片。結果判斷:c-myc以細胞質(zhì)或細胞核呈棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。以PBS代替一抗作陰性對照。隨機選取5個高倍視野進行記數(shù)，每高倍視野記數(shù)100個細胞，共500個細胞，計算c-myc陽性細胞比率。陽性表達率/%=陽性細胞總數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

另外，在選擇審計項目時，不能只注重單個審計項目目標，忽視多個審計項目目標的整體性，而應先確定主要目標，然后圍繞主題，多角度地選擇若干同類項目的子項目開展審計，以求找出共性、全局性的規(guī)律，在更廣泛的范圍內(nèi)提出審計建議，做到標本兼治，在更高層面上發(fā)揮國家審計的“免疫系統(tǒng)”功能。

1.3.5 細胞凋亡率的測定 同上培養(yǎng)和分組干預后，采用Annexin V-FITC結合PI染色、流式細胞術分析細胞的凋亡率。應用1×Annexin V應用液調(diào)整細胞密度1×109·L－1。取100 ml細胞懸液加入到5 ml的離心管中，加入5 ml Annexin V-FITC和5 ml PI，輕輕搖勻，25℃避光15 min。加入500 ml 1×Annexin V應用液重懸細胞，在1 h內(nèi)進行流式細胞分析。以右下象限Annexin V+/PI－為凋亡細胞。

1.3.6 細胞培養(yǎng)上清液膠原蛋白含量的測定 同上培養(yǎng)和分組干預后，采用羥脯氨酸比色法測定細胞培養(yǎng)上清液羥脯氨酸含量，從而間接反映膠原蛋白表達。嚴格按照試劑盒說明書進行操作，酶標儀測定562 nm處的吸光度，根據(jù)標準曲線分別計算樣品中羥脯氨酸和總蛋白的濃度，根據(jù)公式計算培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量(g·L－1培養(yǎng)液)。然后換算出VAF培養(yǎng)上清中膠原的含量。

1.3.7 細胞間膠原蛋白的測定 采用天狼猩紅染色法，同上培養(yǎng)和分組干預后，中性甲醛固定15 min;PBS沖洗3次，加入天狼猩紅－飽和苦味酸液染15～30 min;伊紅復染。逐級脫水、透明，中性樹膠封片。

1.3.8 細胞Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原mRNA的測定RT-PCR法測定VAF的ColⅠ和ColⅢ。同上培養(yǎng)和分組干預。ColⅠ的上、下游引物序列分別為5'-TGCCGTGACCTCAAGATGTG-3'、5'-CACAAGCGTGCTGTAGGTGA-3';ColⅢ的上、下游引物序列分別為 5'-AGATCATGTCTTCACTCAAGTC-3'、5'-TTTACATTGCCATTGGCCTGA-3'。具體步驟:① TRIzol法抽提總 RNA;② RT(20 ml體系):65℃ 5 min，37℃ 50 min逆轉;70℃ 15 min滅活;③ PCR(25 ml體系):94℃預變性5 min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30個循環(huán);72℃終延伸7 min;④電泳:1.2%瓊脂糖凝膠，90 V，電泳30 min;凝膠成像分析儀中觀察、照像;用Alphaimager 2200.spsswin軟件分析電泳結果。

1.4 統(tǒng)計學分析方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析進行處理，方差不齊時采用秩和檢驗。

2 結果

2.1 VAF原代與傳代培養(yǎng) VAF為貼壁生長型細胞，細胞呈長梭形或不規(guī)則多角形，細胞質(zhì)透明，向外伸出2～3個長短不一的偽足，胞核比較大，細胞界限較清楚，生長排列較規(guī)律，多呈放射狀、編織狀或螺旋狀走行。從培養(yǎng)細胞的形態(tài)和生長特性來看，符合成纖維細胞的一般特征。VAF呈Vimentin單抗染色陽性，位于胞質(zhì)，與細胞長軸方向一致，呈棕黃色絲狀網(wǎng)絡及顆粒形態(tài)，陽性率90%以上;而α-actin單抗染色表達陰性(Fig 1)。結果表明體外培養(yǎng)的細胞為成纖維細胞，沒有平滑肌細胞污染。

Fig 1 Cultured cells were identified with staining for Vimentin and α-actin

2.2 對細胞增殖活度的影響 與正常對照組相比，AngⅡ誘導增殖組細胞增殖升高(P＜0.01);與AngⅡ誘導增殖組比較，各用藥組細胞增殖明顯減弱(P＜0.01);與卡托普利組相比，各鉤藤提取物組細胞增殖與之相近(P＞0.05)。見Tab 1。

2.3 對細胞形態(tài)學的影響 藥物干預24 h后結果:正常組細胞呈條索狀，結構完整;誘導增殖組細胞增長旺盛，細胞數(shù)目較多，結構完整;各用藥干預組可見細胞穿孔、皺縮、縮成球狀，個別看到凋亡小體。藥物干預48 h后結果:細胞鋪開的比例比24 h明顯，相同藥物干預后，48 h比24 h細胞的變化明顯，同時細胞數(shù)目有所減少。見Fig 2、3。

Tab 1 VAF proliferation treated with drugs observed by MTT(OD，±s，n=6)

Tab 1 VAF proliferation treated with drugs observed by MTT(OD，±s，n=6)

▲P ＜0.05 vs normal control;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

Group Dose OD Value Normal － 0.64 ±0.09 Ang Ⅱ-induced proliferation 2×10－7mol·L－1 1.04 ±0.01▲Captopril 400 mg·L－1 0.59 ±0.08＊＊Uncaria total alkaloids 200 mg·L－1 0.61 ±0.14＊＊Rhynchophylline 30 mg·L－1 0.56 ±0.11＊＊Isorhynchophylline 30 mg·L－1 0.54 ±0.16＊＊

Fig 2 Cells treated with drugs for 24 hours

2.4 對細胞周期的影響 與正常組相比，AngⅡ誘導增殖組G0/G1期降低(P＜0.05)，S期增高(P＜0.01);與AngⅡ誘導增殖組相比，經(jīng)過各藥物干預24 h后，G0/G1期增高(P＜0.01)，S期降低(P＜0.01);與卡托普利組相比，鉤藤總生物堿組、鉤藤堿組、異鉤藤堿組G0/G1期降低，S期增高，但兩者差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見Tab 2。

2.5 對細胞 c-myc蛋白的影響 與正常細胞組相比，AngⅡ誘導增殖組c-myc蛋白表達水平明顯升高，二者差異具有顯著性(P＜0.01);與AngⅡ誘導增殖組相比，各用藥干預組c-myc蛋白表達水平均明顯降低(P＜0.01)。見Fig 4、Tab 3。

2.6 對細胞凋亡的影響 與正常細胞組相比，AngⅡ誘導增殖組凋亡率有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與AngⅡ誘導增殖組比較，各用藥干預組凋亡率趨于升高，差異具有顯著性(P＜0.01)。見Tab 3。

Fig 3 Cells treated with drugs for 48 hours

Fig 4 c-Myc protein immunohistochemistry

2.7 對細胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸含量的影響 與AngⅡ組相比較，各用藥細胞株所分泌的羥脯氨酸均有不同程度降低，其中鉤藤堿組、異鉤藤堿組和總生物堿組降低差異具有顯著性(P＜0.05)。見Tab 3。

2.8 對細胞間膠原表達的影響 在天狼猩紅－飽和苦味酸染色下，光鏡觀察可見膠原纖維呈猩紅色、細胞核呈綠色、其他成分呈黃色。正常組VAF間即存在膠原纖維表達，而AngⅡ誘導增殖組表達較強，紅色表現(xiàn)較重。與AngⅡ組比較，各用藥組膠原表達均有不同程度的減輕，紅色表現(xiàn)有不同程度的范圍變小，著色變淺。見Fig 5。

2.9 對細胞ColⅠmRNA和ColⅢ mRNA的影響 與AngⅡ組相比較，各用藥細胞株ColⅠ/βactin均有不同程度降低，其中異鉤藤堿組和卡托普利組降低差異具有顯著性(P＜0.05)。與AngⅡ組相比較，各用藥細胞株ColⅢ /β-actin均有不同程度降低，其中鉤藤堿組和異鉤藤堿組降低差異具有顯著性(P＜0.05)。見Tab 4。

Tab 2Cell cycle of VAF(±s，n=3)

Tab 2Cell cycle of VAF(±s，n=3)

▲P ＜0.05 vs normal control;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

Group Dose G0/G1 G2/M S Normal － 74.30 ±3.09 9.25 ±0.94 16.46 ±2.16 AngⅡ-induced proliferation 2×10 －7mol·L－1 65.79 ±7.26▲ 11.29 ±1.01 23.93 ±2.33▲Captopril 400 mg·L－1 82.21 ±6.57＊＊ 9.78 ±1.00 8.01 ±3.57＊＊Uncaria total alkaloids 200 mg·L －1 75.89 ±5.12* 10.15 ±2.14 14.04 ±2.76*Rhynchophylline 30 mg·L－1 77.18 ±2.29＊＊ 11.80 ±1.23 11.32 ±2.45＊＊Isorhynchophylline 30 mg·L－1 76.87 ±1.26＊＊ 8.96 ±1.41 12.98 ±2.54＊＊

Tab 3 c-myc protein immunohistochemistry，rate of VAF apoptosis and extracellular VAF hydroxyproline concentration in culture supernatant(±s，n=6，mg·L－1culture supernatant)

Tab 3 c-myc protein immunohistochemistry，rate of VAF apoptosis and extracellular VAF hydroxyproline concentration in culture supernatant(±s，n=6，mg·L－1culture supernatant)

▲P ＜0.05 vs normal control;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

Group Dose Percentage os positive size of c-my c protein Apoptotic rate/% Hyp Normal － 1.25 ±0.72 11.61 ±0.83 2.34 ±0.22 AngⅡ-induced proliferation 2×10 －7mol·L －1 27.36 ±3.78▲ 13.53 ±0.79 7.29 ±1.32▲Captopril 400 mg·L－1 13.55 ±4.94＊＊ 30.77 ±2.34＊＊ 4.53 ±0.56*Uncaria total alkaloids 200 mg·L－1 14.36 ±3.22＊＊ 23.36 ±3.22* 3.09 ±0.48*Rhynchophylline 30 mg·L －1 17.15 ±2.87* 21.15 ±2.87* 3.12 ±0.54*Isorhynchophylline 30 mg·L －1 18.26 ±4.32* 22.26 ±2.32* 4.85 ±1.22*

3 討論

VAF異常增殖及膠原合成是高血壓血管重塑的重要病理變化，是在各種外界剌激的作用下，細胞外信號經(jīng)過細胞內(nèi)信號傳遞系統(tǒng)到達核內(nèi)，誘導一系列與VAF增殖相關的基因表達，啟動細胞周期，從而推動 VAF分裂、增殖以及膠原沉積［6－8］。因此，抑制VAF增殖和膠原沉積不僅是抗高血壓血管重塑的基本策略，同時也是研制新型抗高血壓藥的基本目標。

Tab 4mRNA expression of ColⅠand ColⅢ(±s，n=3)

Tab 4mRNA expression of ColⅠand ColⅢ(±s，n=3)

▲P＜0.05 vs normal control;*P＜0.05 vs model

Group Dose β-actin ColⅠ ColⅢ ColⅠ/β-actin ColⅢ /β-actin Normal － 34730±6987 33512±7124 16241±9870 0.965 ±0.112 0.468 ±0.092 AngⅡ-induced proliferation 2×10－7mol·L－1 38808±7123 38856 ±5126 21983 ±7680 1.001±0.082 0.556±0.114▲Captopril 400 mg·L－1 35800 ±3684 28867 ±5864 16452 ±8760 0.801 ±0.087* 0.495 ±0.104 Rhynchophylline 30 mg·L－1 35956 ±4910 30665 ±5674 14520 ±8792 0.853 ±0.092 0.404 ±0.120*Isorhynchophylline 30 mg·L－1 37498 ±8750 30090 ±6742 16875 ±5904 0.802 ±0.097* 0.450 ±0.089*

AngⅡ異常分泌與VAF增殖相關，在體外有促進培養(yǎng) VAF 增殖的作用［9－10］，故以 Ang Ⅱ 刺激VAF建立細胞增殖模型，以此為研究平臺，探討了鉤藤堿和異鉤藤堿對VAF增殖的影響，分析細胞增殖動力學特征。結果表明鉤藤堿和異鉤藤堿可抑制AngⅡ的促VAF增殖效應，增加G0/G1期細胞百分含量，減少S期細胞的百分含量，阻斷細胞由G0/G1期向S期轉化。

原癌基因的激活及其表達異常是細胞增殖的內(nèi)在基礎，其中c-myc較受關注。c-myc基因的激活是VAF增殖的重要因素，其表達增高與VAF增殖密切相關。本實驗發(fā)現(xiàn)，鉤藤堿和異鉤藤堿抗VSMC增殖作用是通過從翻譯水平抑制c-myc基因表達來實現(xiàn)的。經(jīng)鉤藤堿和異鉤藤堿干預后，其AngⅡ誘導的c-myc基因表達明顯減弱，表明鉤藤堿和異鉤藤堿可通過下調(diào)原癌基因c-myc蛋白表達來阻斷AngⅡ的促VAF增殖效應。

Fig 5 Collagen of Sirius Red saturated picric acid staining

AngⅡ異常分泌與膠原合成相關，在體外有促進膠原合成的作用［11－12］，故以 AngⅡ刺激 VAF誘導膠原合成，以此為基礎，探討了鉤藤堿和異鉤藤堿對VAF合成膠原的影響及作用機制。結果表明，鉤藤堿和異鉤藤堿具有降低細胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸含量、抑制細胞間膠原合成的作用，進一步機制是通過從轉錄水平抑制血管成纖維細胞ColⅠ和ColⅢ表達來實現(xiàn)的。經(jīng)鉤藤堿和異鉤藤堿干預后，其AngⅡ誘導的血管成纖維細胞ColⅠ和ColⅢ表達明顯減弱，從而表明鉤藤堿和異鉤藤堿可通過下調(diào)血管成纖維細胞ColⅠ和ColⅢ表達來阻斷AngⅡ的促膠原合成效應。

AngⅡ在體外促進培養(yǎng)VAF增殖的同時是否對細胞凋亡有影響尚不清楚，故以AngⅡ刺激的VAF為研究平臺，探討AngⅡ對VAF凋亡的影響以及鉤藤堿和異鉤藤堿的干預作用。表明AngⅡ可促進VAF凋亡，提高VAF凋亡率，而鉤藤堿和異鉤藤堿可增強AngⅡ的促VAF凋亡效應，進一步提高細胞凋亡率。

綜上所述，鉤藤堿和異鉤藤堿對AngⅡ介導的VAF增殖和膠原合成具有明顯的抑制作用，其部分機制與其阻滯血管平滑肌細胞G0/G1期向S期轉化以及下調(diào)c-myc蛋白表達以及VAF的ColⅠmRNA和ColⅢ mRNA轉錄有關;具有誘導AngⅡ介導的VAF凋亡的作用，從而對體現(xiàn)出中藥多途徑、多靶點及整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢，因而可以推斷鉤藤堿和異鉤藤堿對防治高血壓血管重塑的發(fā)生發(fā)展具有積極的意義。

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