在Hs578T乳腺癌細(xì)胞由Cx43組成的細(xì)胞縫隙連接對(duì)阿霉素細(xì)胞毒性的影響

蔣國(guó)君，童旭輝，祝曉光，董淑英，韓 溪，鄭 超

(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系藥理學(xué)教研室，安徽蚌埠 233030)

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，化療是常見(jiàn)的治療手段。阿霉素(adriamycin，ADM)易產(chǎn)生心臟毒性、骨髓抑制、消化道反應(yīng)等嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此尋找增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)ADM敏感性同時(shí)降低機(jī)體不良反應(yīng)的方法，對(duì)減少耐藥、增加ADM的療效和擴(kuò)大其臨床應(yīng)用范圍具有重要的指導(dǎo)意義。

細(xì)胞縫隙連接(gap junction，GJ)是細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)交流的主要連接通道，由特殊的通道蛋白——連接蛋白(connexin，Cx)組成。連接蛋白通道介導(dǎo)的細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于細(xì)胞正常生理狀態(tài)的維持以及機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定非常重要［1］。

目前已經(jīng)證實(shí)，在人正常的乳腺組織中，Cx43是乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)的特異性連接蛋白之一［2］，具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，并且有研究證明，Cx43的存在可以增強(qiáng)化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用［3］。在乳腺癌細(xì)胞中Cx43基因表達(dá)常常異?；蛘呷笔В?］。因此，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者也將提高腫瘤間GJIC功能作為了腫瘤治療研究的新方向［5－6］。

本實(shí)驗(yàn)主要研究維甲酸(ratinoic acid，RA)、油酸酰胺(oleamide)和 18-α-甘草次酸(18-α-GA)對(duì)乳腺癌Hs578T細(xì)胞中Cx43表達(dá)的影響，進(jìn)而觀察由Cx43形成的GJ對(duì)抗腫瘤藥物ADM細(xì)胞毒性的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 細(xì)胞 細(xì)胞系Hs578T購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 試劑 阿霉素、胰蛋白酶(Typsin)、MTT、二甲基亞砜(DMSO)均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;DMEM高糖培養(yǎng)基、新生牛血清、熒光染料CM-Dil、calcein-AM(Molecular Probes)均為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品。其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞 Hs578T采用DMEM高糖培養(yǎng)基，含有10%(V/V)新生牛血清，100 kU·L－1青霉素，100 mg·L－1鏈霉素，置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2以及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代，一周傳代2～3次，傳代比例約為1∶3。

1.2.2 Western blot檢測(cè) Hs578T細(xì)胞內(nèi) Cx43蛋白表達(dá) 收集穩(wěn)定表達(dá)Cx43的乳腺癌細(xì)胞Hs578T，用細(xì)胞裂解液(總體積200 ml:100 mmol·L－1Tris-HCl pH 7.4 20 ml、1 mol·L－1NaCl 28 ml、100 mmol·L－1CaCl21 ml、100 mmol·L－1MgCl221 ml、15 mmol·L－1NaN340 ml、Triton X-100 2 ml，用前加入蛋白酶抑制劑 12 μmol·L－1Leupeptin、1 mmol·L－1PMSF 各2 ml·L－1)冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量法(參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作)測(cè)各組蛋白濃度，用細(xì)胞裂解液將各組蛋白稀釋至相同濃度，與2×上樣緩沖液1∶1混合，100℃煮沸5 min使蛋白變性。取蛋白 200 μg/組，12%SDSPAGE 凝膠電泳(70 V，30 min;150 V，90 min);轉(zhuǎn)膜(50 V，180 min);5%脫脂牛奶室溫封閉過(guò)夜;一抗:1∶4 000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜;TPBS洗滌3次×15 min;二抗1∶4 000稀釋?zhuān)覝胤跤? h;TPBS洗滌3次×15 min，PBS洗滌1次×15 min;ECL發(fā)光試劑盒暗室發(fā)光、顯影、定影。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光法 檢測(cè)細(xì)胞膜Cx43蛋白表達(dá) 將細(xì)胞以5×104cells·L－1的密度接種于蓋玻片上，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，吸去培養(yǎng)基，PBS洗2次×5 min;4%多聚甲醛－0.1%Triton溶液室溫固定10 min，PBS洗2次×10 min;1%BSA封片2 h;一抗:1∶1 000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次×10 min;二抗1∶500稀釋?zhuān)瑵窈?7℃孵育2 h，PBS洗滌3次×10 min;碳酸甘油緩沖液封片;倒置熒光顯微鏡檢測(cè)。

1.2.4 細(xì)胞接種熒光示蹤法(Parachute Assay)測(cè)定Hs578T細(xì)胞間GJ功能 將表達(dá)有Cx43的乳腺癌細(xì)胞與熒光指示劑calcine-AM共同孵育，使calcine-AM進(jìn)入細(xì)胞。該細(xì)胞稱為“供體細(xì)胞”(donor cell)。將“供體細(xì)胞”接種到表達(dá)有相同Cx，已生長(zhǎng)融合的 Hs578T細(xì)胞(“接受細(xì)胞”，receiver cells)上，培養(yǎng)4 h。待形成穩(wěn)定的GJ后，小分子的calcine(發(fā)綠色熒光)可以通過(guò)GJ進(jìn)入相鄰的“接受細(xì)胞”，用熒光顯微鏡觀察，記錄GJ熒光傳遞功能。一個(gè)“供體細(xì)胞”周?chē)衏alcine的“接受細(xì)胞”數(shù)目多少作為GJ功能指標(biāo)［7］。分別用GJ功能增強(qiáng)劑維甲酸鈉(RA)誘導(dǎo)細(xì)胞24 h，GJ功能抑制劑oleamide、18-α-GA分別誘導(dǎo)細(xì)胞 1h后，觀察細(xì)胞GJ功能改變(即熒光傳遞的變化)［8］。

1.2.5 MTT法檢測(cè)GJ功能對(duì)ADM細(xì)胞毒性的影響 將細(xì)胞按每孔190 μl(細(xì)胞密度為5×107cells·L－1)接種于96孔板，每組藥物濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，藥物終濃度如下:1.5、3.0、6.0、12、24、48 μmol·L－1。檢測(cè)每組藥物濃度處理Hs578T細(xì)胞后24、48和72 h的細(xì)胞存活率，另設(shè)陰性對(duì)照組(不加藥物)和空白對(duì)照組(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)基)。加藥后24～72 h(藥物作用終點(diǎn)時(shí)間)終止培養(yǎng)，終止培養(yǎng)前4 h，每孔加 MTT 15 μl(5 g·L－1)，棄上清液，加入二甲基亞砜150 μl/孔，微量振蕩器震搖10 min，全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的570 nm波長(zhǎng)處吸光度A值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。在細(xì)胞融合狀態(tài)下用GJ功能調(diào)節(jié)劑改變細(xì)胞GJ功能，觀察藥物處理細(xì)胞24 h后的細(xì)胞存活率。各試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)資料以±s表示，兩組之間計(jì)量資料比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)圖表采用Sigma Plot繪制。

2 結(jié)果

2.1 Hs578T細(xì)胞天然表達(dá)Cx43蛋白 本研究采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞Cx43蛋白［9］，如Fig 1結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，10μmol·L－1RA預(yù)處理Hs578T細(xì)胞24 h，可以增加細(xì)胞Cx43表達(dá)水平。25 μmol·L－1的 oleamide 和 10 μmol·L－1的 18-α-GA分別預(yù)處理Hs578T細(xì)胞24 h，明顯降低細(xì)胞Cx43表達(dá)水平。

2.2 Hs578T細(xì)胞胞膜Cx43的表達(dá) 本研究在天然表達(dá)Cx43的Hs578T細(xì)胞，用“細(xì)胞免疫熒光法”(Immunofluorescence Assay)檢測(cè)Hs578T細(xì)胞膜上Cx43的表達(dá)(Fig 2)。

2.3 抗腫瘤藥物在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)Hs578T細(xì)胞的增殖抑制作用 不同濃度ADM刺激Hs578T細(xì)胞24、48和72 h，使用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率。由 Fig 3 可以看出:1.5 μmol·L－1～48 μmol·L－1的ADM作用組的細(xì)胞存活率明顯降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著ADM濃度增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率也明顯降低，即呈時(shí)間、劑量依賴性。48.0 μmol·L－1ADM 處理 Hs578T 細(xì)胞 24、48和72 h后，細(xì)胞存活率分別為55.23%、25.89%和18.18%。

2.4 用藥物改變GJ功能對(duì)ADM細(xì)胞毒性的影響

2.4.1 GJ功能增強(qiáng)劑對(duì)ADM細(xì)胞毒性的影響

2.4.1.1 RA 對(duì)由 Cx43組成的 GJ熒光傳遞功能的影響 本實(shí)驗(yàn)用 parachute方法，在天然表達(dá)Cx43 的 Hs578T 細(xì)胞中，觀察 RA(10 μmol·L－1)對(duì)由Cx43組成的GJ熒光傳遞功能的影響(Fig 4，5)。

Fig 1 Effect of RA，oleamide or 18-α-GA on the expression of Cx43 in Hs578T(±s，n=3)

Fig 2 Expression of Cx43 on the surface of Hs578T cells(n=3)

Fig 5的結(jié)果顯示，用RA預(yù)處理Hs578T細(xì)胞24 h，可以明顯增強(qiáng)由Cx43組成的GJ熒光傳遞功能。與對(duì)照組相比，RA處理后的細(xì)胞熒光傳遞率增強(qiáng)了39.52%。

Fig 3 Surviving fraction of Hs578T cells treated with ADM for 24，48 and 72 h(n=3)

Fig 5 Effect of RA on the dye spread through GJ composed of Cx43 in Hs578T cells(±s，n=3)

2.4.1.2 RA對(duì)ADM細(xì)胞毒性的影響 本實(shí)驗(yàn)在Hs578T細(xì)胞生長(zhǎng)融合(有GJ形成)和生長(zhǎng)未融合(無(wú) GJ形成)的狀態(tài)下，預(yù)先用 10 μmol·L－1的 RA處理細(xì)胞24 h增強(qiáng)GJ功能，然后再加入6 μmol·L－1的ADM，作用24 h后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率(Fig 6)。

Fig 6的結(jié)果顯示，在高密度接種的細(xì)胞(生長(zhǎng)融合，有GJ形成)，ADM單用組的細(xì)胞存活率為0.54±0.04，低密度接種的細(xì)胞(生長(zhǎng)未融合，無(wú)GJ形成)，ADM單用組的細(xì)胞存活率0.59±0.03。高密度接種的細(xì)胞，用RA(本身對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響)預(yù)處理細(xì)胞以增強(qiáng) GJ功能后，6 μmol·L－1的 ADM作用Hs578T細(xì)胞24 h，細(xì)胞的存活率低于單用ADM 的細(xì)胞(0.49±0.04，P＜0.01);結(jié)果表明，RA可以增強(qiáng)ADM的細(xì)胞毒性。而在低密度接種的細(xì)胞(生長(zhǎng)未融合，無(wú) GJ形成)，用 RA預(yù)處理后，ADM作用于細(xì)胞24 h，細(xì)胞的存活率與單用ADM組相比增加(0.65±0.04，P＜0.01)。

Fig 6 Effect of RA on cytotoxicity of ADM in Hs578T cells expressing Cx43(±s，n=3)

以上結(jié)果可以證明，在有GJ形成的細(xì)胞，RA可以增強(qiáng)抗腫瘤藥物ADM的細(xì)胞毒性，而在無(wú)GJ形成的細(xì)胞，RA不能對(duì)細(xì)胞間GJ進(jìn)行調(diào)控。

2.4.2 GJ功能抑制劑對(duì)ADM細(xì)胞毒性的影響在天然表達(dá)Cx43的Hs578T細(xì)胞中，為了進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞GJ對(duì)抗腫瘤藥物ADM細(xì)胞毒性的影響，本實(shí)驗(yàn)采用公認(rèn)的GJ功能抑制劑oleamide和18-α-GA，在細(xì)胞融合(有GJ形成)和細(xì)胞未融合(無(wú)GJ形成)兩種情況下觀察它們對(duì)ADM的細(xì)胞毒性的影響。

2.4.2.1 oleamide 和18-α-GA 對(duì)由 Cx43 組成的GJ熒光傳遞功能的影響 Oleamide和18-α-GA是目前公認(rèn)的 GJ抑制劑［10－11］，能抑制由 Cx43，Cx37 等連接蛋白組成的GJ，因此，我們首先用parachute的方法學(xué)觀察這兩種抑制劑在天然表達(dá)Cx43的Hs578T細(xì)胞中對(duì)由Cx43組成的GJ熒光傳遞功能的影響(Fig 7，8)。

Fig 7 Effect of oleamide or 18-α-GA on dye spread in Hs578T cells expressing Cx43(n=3)

Fig 8 Effect of oleamide or 18-α-GA on the dye spread through GJ composed of Cx43 in Hs578T cells(±s，n=3)

Fig 8的結(jié)果顯示，用oleamide和18-α-GA預(yù)處理Hs578T細(xì)胞1 h，均可以抑制由Cx43組成的GJ熒光傳遞。與對(duì)照組相比，oleamide(25 μmol·L－1)或 18-α-GA(10 μmol·L－1)處理的 Hs578T 細(xì)胞，其熒光傳遞率分別降低了47.94%和66.19%。結(jié)果證明，oleamide和18-α-GA可以降低由Cx43組成的GJ功能。

2.4.2.2 oleamide 和 18-α-GA 對(duì) ADM 細(xì)胞毒性的影響 本實(shí)驗(yàn)在Hs578T細(xì)胞生長(zhǎng)融合(有GJ形成)和生長(zhǎng)未融合(無(wú)GJ形成)的狀態(tài)下，預(yù)先用25 μmol·L－1的 oleamide 和 10 μmol·L－1的 18-α-GA分別處理細(xì)胞 1 h，然后再加入 6 μmol·L－1的ADM，作用24 h后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率(Fig 9)。

Fig 9 Effect of oleamide or 18-α-GA on the cytotoxicity of ADM in Hs578T cells expressing Cx43(±s，n=3)

Fig 9結(jié)果顯示:在高密度接種的細(xì)胞(生長(zhǎng)融合，有GJ形成)，ADM單用組的細(xì)胞存活率為0.54±0.04，低密度接種的細(xì)胞(生長(zhǎng)未融合，無(wú)GJ形成)，ADM單用組的細(xì)胞存活率為0.59±0.03。高密度接種的細(xì)胞，與單用ADM組相比，用oleamide(25 μmol·L－1)或 18-α-GA(10 μmol·L－1)(兩藥本身對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響)預(yù)處理細(xì)胞1 h后，6 μmol·L－1的ADM作用Hs578T細(xì)胞24 h，細(xì)胞的存活率明顯增加(P＜0.01);結(jié)果表明，在有GJ形成的細(xì)胞，oleamide和18-α-GA能降低ADM的細(xì)胞毒性。而在低密度接種的細(xì)胞(生長(zhǎng)未融合，無(wú)GJ形成)，與 ADM 單用組相比，用 oleamide或18-α-GA，不影響ADM處理后的細(xì)胞存活率(P＞0.05)。

以上結(jié)果可以證明，在有 GJ形成的細(xì)胞，oleamide和18-α-GA可以抑制抗腫瘤藥物ADM的細(xì)胞毒性，而在無(wú)GJ形成的細(xì)胞，oleamide和18-α-GA不能對(duì)細(xì)胞間GJ進(jìn)行調(diào)控，因此對(duì)ADM的細(xì)胞毒性無(wú)影響。

3 討論

Cx已經(jīng)成為乳腺癌治療的熱點(diǎn)，該蛋白在不同組織中表達(dá)不同，其中Cx43是乳腺上皮細(xì)胞主要表達(dá)的連接蛋白，Cx43異常與乳腺癌之間的關(guān)系越來(lái)越受到關(guān)注。

腫瘤化療藥物的作用在某些情況下與細(xì)胞GJ功能密切相關(guān)［12－13］，文獻(xiàn)報(bào)道，恢復(fù)和上調(diào)腫瘤細(xì)胞的GJIC功能，可降低抗腫瘤藥物的濃度并降低其不良反應(yīng)。其調(diào)節(jié)途徑主要有兩種:第一種是通過(guò)藥物誘導(dǎo)方法來(lái)恢復(fù)和上調(diào)腫瘤細(xì)胞GJIC功能。藥物誘導(dǎo)主要是通過(guò)藥物來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中Cx表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞GJ的形成，從而加強(qiáng)細(xì)胞間的物質(zhì)交流，如維生素 D、類(lèi)維生素 A、某些黃酮類(lèi)的藥物［3，14－16］等均可以通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞的 GJ功能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和增殖。第二種途徑是通過(guò)基因轉(zhuǎn)染的方法來(lái)恢復(fù)和上調(diào)腫瘤細(xì)胞的GJIC功能。

本實(shí)驗(yàn)所選用的Hs578T細(xì)胞株天然表達(dá)Cx43，目前常用的GJ功能增強(qiáng)劑為RA，該藥物可以通過(guò)增加Cx43mRNA轉(zhuǎn)錄、Cx43蛋白的表達(dá)而增強(qiáng)GJ功能［17］。本實(shí)驗(yàn)觀察了RA對(duì)乳腺癌細(xì)胞Hs578T中Cx43蛋白水平的影響，及對(duì)GJ功能的影響。結(jié)果顯示，RA可以明顯增強(qiáng) Cx43蛋白的表達(dá)，及乳腺癌細(xì)胞中由此連接蛋白形成的GJ功能。本研究進(jìn)一步在高密度(有GJ形成)和低密度(無(wú)GJ形成)兩種條件下觀察對(duì)ADM細(xì)胞毒性的影響，結(jié)果顯示，在GJ形成的Hs578T細(xì)胞中，RA可以明顯增強(qiáng)ADM的細(xì)胞毒性，表明RA增強(qiáng)ADM的細(xì)胞毒性是通過(guò)GJ實(shí)現(xiàn)的。

oleamide和18-α-GA是本實(shí)驗(yàn)采用的兩種GJ功能抑制劑。oleamide的作用途徑尚不明確，通常認(rèn)為該藥是通過(guò)選擇性地抑制鈣離子通過(guò)GJ的能力，從而抑制細(xì)胞的群體死亡［18］，油酸酰胺衍生物MI-18和MI-22，通過(guò)抑制由Cx26介導(dǎo)的GJIC，阻止細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)移，并且藥物的毒副作用較低［19］，但是對(duì)于oleamide對(duì)Cx43蛋白表達(dá)影響的研究較少。本研究證明，oleamide和18-α-GA均可不同程度地抑制乳腺癌細(xì)胞Hs578T中Cx43蛋白的表達(dá)，以及由Cx43形成的GJ的熒光傳遞，細(xì)胞毒性結(jié)果顯示，oleamide和 18-α-GA通過(guò)抑制 GJ功能，可降低ADM對(duì)Hs578T的細(xì)胞毒性。

本研究通過(guò)改變GJ的功能下測(cè)定ADM細(xì)胞毒性的方法證實(shí)了，由Cx蛋白形成的GJ功能對(duì)ADM抗腫瘤作用的影響，結(jié)果表明，改變和調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞中Cx蛋白的表達(dá)可能會(huì)為乳腺癌治療提供一個(gè)新的思路。

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