卡立泊來德對K562細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成的影響

高 偉，馬 麗，張洪菊，張玉娟，常國強(qiáng)，王 建，李華文，龐天翔

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院、血液學(xué)研究所、血液病醫(yī)院，實驗血液學(xué)國家重點實驗室，天津 300020)

血管生成不僅在實體腫瘤中，而且在血液惡性腫瘤中發(fā)揮非常重要的作用［1］。在急性髓系白血病和急性淋系白血病骨髓標(biāo)本中可以觀察到明顯的血管密度增加［2－3］。血管生成是受正性和負(fù)性調(diào)節(jié)因子共同調(diào)節(jié)的，通過這兩類因子的相互平衡來維持正常的血管生成［4］。當(dāng)這種平衡被破壞，促血管生成因子占主導(dǎo)時便發(fā)生病理性血管新生從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是最常見的強(qiáng)力促血管生成因子，在腫瘤血管新生中發(fā)揮重要的作用。鈉氫交換蛋白1(NHE1)是一種在哺乳動物中廣泛表達(dá)的膜蛋白，其主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的pH值(pHi)。越來越多的實驗表明鈉氫交換蛋白蛋白1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［5－8］。其新的抑制劑 cariporide具有更高的特異性和相對較小的毒副作用，已經(jīng)被加拿大和美國用于治療心肌缺血/再灌注損傷［9］。本研究通過觀察cariporide處理后K562上清液對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移以及成管能力的影響，探討其在K562細(xì)胞誘導(dǎo)血管生成方面的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 K562細(xì)胞由本實驗室保存;RPMI 1640培養(yǎng)液為 Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清和M199培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品;cariporide購自Sigma公司;Transwell小室購自Millipore公司;Matrigel(生長因子減少型)購自BD公司;雙羧乙基碳氧熒光素四乙酰氧甲酯(BCECF-AM)熒光染料和尼日利亞菌素(Nigericin)均購于Calbiochem公司;人VEGF酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自R＆D公司。

1.2 儀器 Forma 371型恒溫培養(yǎng)箱為Thermo公司產(chǎn)品;CK型倒置光學(xué)顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品;激光掃描共焦顯微鏡(TCS SP2)為德國LEICA公司產(chǎn)品;Synergy H4型酶標(biāo)儀為美國Biotek公司產(chǎn)品。

1.3 K562上清液的制備及ELISA檢測 取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞1.5×106加于無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，分別加入或者不加入10 μmol·L－1的 cariporide，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，離心收集上清液備用。按照ELISA試劑盒說明書分別檢測兩種上清液中VEGF的含量。

1.4 HUVEC 細(xì)胞的培養(yǎng)參照J(rèn)effe等［10］的方法用0.3%的胰酶消化臍靜脈內(nèi)皮，將收集的細(xì)胞加于M199培養(yǎng)基中，其中含20%胎牛血清、青霉素(100 kU·L－1)鏈霉素(100 mg·L－1)，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 MTT法檢測cariporide對K562細(xì)胞上清液誘導(dǎo)的HUVEC增值的影響 取對數(shù)生長期的HUVEC，按每5×103接種于96孔板中，分別加入1∶1的cariporide處理和不處理的K562細(xì)胞上清液和M199培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，加入5 g·L－1的 MTT工作液每孔20 μl，孵育4 h，離心后棄上清，加入 DMSO每孔100 μl，震蕩10 min使結(jié)晶充分溶解，使用酶標(biāo)儀在波長570 nm時檢測吸光度值，實驗重復(fù)3次。

1.6 Transwell檢測cariporide對K562細(xì)胞上清液誘導(dǎo)的HUVEC遷移的影響 HUVEC細(xì)胞以1×109·L－1的密度重懸在無血清的 M199培養(yǎng)液中，以100 μl體積接種于 transwell小室的上室，下室加入500 μl的1∶1的cariporide處理和不處理的K562細(xì)胞上清液和M199培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)12 h。取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)的非遷移細(xì)胞，倒置，風(fēng)干，用0.1%結(jié)晶紫對小室背面遷移的細(xì)胞進(jìn)行染色，PBS洗凈多余染液。33%醋酸脫色，分光光度計測定吸光值。

1.7 基質(zhì)膠血管形成法檢測cariporide對K562細(xì)胞上清液誘導(dǎo)的HUVEC成管的影響 將基質(zhì)膠在4℃融化過夜，按照每孔50 μl加入96孔板中，37℃孵育30 min使之凝固。將HUVEC重懸在1∶1的cariporide處理和不處理的 K562細(xì)胞上清液和M199培養(yǎng)液中，每孔加入150 μl含有1×104HUVEC細(xì)胞的的細(xì)胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h觀察血管形成，并在40倍顯微鏡下拍照記錄。

1.8 細(xì)胞內(nèi) pH值測定 參照王若君等［11］的方法，分別檢測Cariporide處理前后K562細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)pH值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 cariporide對K562上清液誘導(dǎo)的HUVEC增殖的影響 MTT檢測結(jié)果顯示(Fig 1)，cariporide處理組的OD值與對照組的OD值比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，cariporide明顯抑制 K562細(xì)胞上清液誘導(dǎo)的HUVEC增殖。

2.2 Cariporide對 K562上清液誘導(dǎo)的 HUVEC遷移的影響 Transwell實驗顯示(Fig 2)，cariporide處理明顯抑制K562細(xì)胞上清液誘導(dǎo)的HUVEC遷移，實驗組的OD值與對照組OD值比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 Cariporide對K562上清液誘導(dǎo)的 HUVEC成管能力的影響 Fig 3結(jié)果顯示，cariporide處理組與對照組相比，HUVEC形成的管狀結(jié)構(gòu)分支數(shù)量和長度均減少，cariporide明顯抑制K562細(xì)胞上清液誘導(dǎo)的HUVEC成管能力。

2.4 Cariporide對K562細(xì)胞內(nèi)pH的影響 Cariporide處理后，K562細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)pH由7.12±0.07下降到6.95±0.08，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 Cariporide對K562分泌VEGF能力的影響ELISA結(jié)果顯示(Fig 4)，cariporide處理后，K562細(xì)胞分泌VEGF能力明顯下降(P＜0.05)。

Fig 1 Effect of CM from cariporide treated K562 cells on HUVEC proliferation(±s，n=5)

Fig 2 Effect of CM from cariporide treated K562 cells on HUVEC migration(±s，n=5)

Fig 3 Effect of cariporide on HUVECs in vitro tube formation

Fig 4 Inhibitory effect of cariporide treatment on the secretion of VEGF(±s，n=5)

3 討論

所有的實體腫瘤生長都需要經(jīng)歷沒有血管支持的和隨后的需要血管支持的兩個階段。由于血液惡性腫瘤主要是在骨髓和淋巴器官積累，所以人們最初以為血管生成對于血液惡性腫瘤并不是不可或缺的。然而，由于骨髓和淋巴結(jié)血管密度增加有助于為惡性細(xì)胞提供營養(yǎng)和氧氣，骨髓的內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞可以以旁分泌的方式分泌細(xì)胞因子和生長因子為惡性細(xì)胞的增殖和存活提供支持。越來越多的臨床研究表明血管生成與血液惡性腫瘤的疾病進(jìn)展，診斷以及預(yù)后息息相關(guān)。鈉氫交換蛋白1(NHE1)是一種在哺乳動物中廣泛表達(dá)的膜蛋白，之前的研究表明NHE1在髓系白血病細(xì)胞系中高度激活以維持細(xì)胞內(nèi)堿性的pH值［12］。

腫瘤血管生成是由內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞與其微環(huán)境相互作用的結(jié)果，其中內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化是新生血管形成過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，VEGF在這一過程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用［13－14］。我們的實驗結(jié)果表明，應(yīng)用NHE1特異性的抑制劑cariporide處理后，K562細(xì)胞上清液對HUVEC的增殖、遷移、分化的誘導(dǎo)作用都明顯下降。Cariporide是一種毒副作用很小的特異抑制劑，其IC50在0.03－3.4 mmol·L－1，我們實驗室之前的研究結(jié)果表明在本實驗中采用的10μmol·L－1濃度對K562細(xì)胞基本沒有細(xì)胞毒性，cariporide處理后引起這種抑制作用的原因是cariporide抑制NHE1的鈉氫交換活性，造成細(xì)胞內(nèi)酸化，從而引起VEGF的分泌減少。

綜上所述，應(yīng)用NHE1特異性抑制劑cariporide可以抑制K562細(xì)胞上清液誘導(dǎo)血管生成的能力。這種抑制作用主要是通過降低細(xì)胞內(nèi)pH值和減少VEGF分泌引起的。本研究有助于進(jìn)一步了解血液惡性腫瘤血管生成的機(jī)制，為臨床上的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。

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