DATS對LPS誘導ALI小鼠抗氧化功能及ICAM-1表達的影響

朱桂軍，孟志強，李 娟，武新慧，王瀾濤，陳玉紅，胡振杰

(1.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院重癥醫(yī)學科，河北 石 家莊 050011;2.邢臺醫(yī)學高等專科學校，河北 邢臺 054000)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的發(fā)病機制復雜，至今尚無特殊有效的治療方法。肺部氧化/抗氧化平衡失調(diào)在ALI病程中起重要作用。炎癥反應時的氧化應激是ALI的重要發(fā)病機制之一，減少活性自由基團的產(chǎn)生，保護氧化/抗氧化平衡，是ALI研究的一個重要方面［1－2］。二烯丙基三硫(diallyl trisulfide，DATS)是大蒜提取物的主要有效成分，具有明確的抗氧化作用［3－4］。我們前期研究表明，預防性應用DATS對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的小鼠具有保護作用［5］。本研究主要探討DATS的抗炎及抗ALI作用是否與其抗氧化作用有關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康♂無熱原昆明(KM)小鼠48只，體質(zhì)量18～22 g之間，河北省實驗動物中心提供。于控制的條件下飼養(yǎng)，12 h∶12 h光-暗周期，給予標準小鼠飼料。實驗動物適應環(huán)境后，腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS(E.coli0111:B4，Sigma公司)建立小鼠肺損傷模型［6］。實驗動物隨機分為4組:① ALI組，每天腹腔注射等體積生理鹽水1次，連續(xù)注射7 d后，腹腔注射LPS 10 mg·kg－1;② DATS預防組，每天腹腔注射DATS(大蒜素注射液，山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，國藥準字:H20054020，)30 mg·kg－1一次，連續(xù)注射 7 d后，腹腔注射LPS 10 mg·kg－1;③ DATS治療組，每天腹腔注射與DATS等體積生理鹽水1次，連續(xù)注射7 d后，腹腔注射 LPS 10 mg·kg－1，之后30 min再腹腔注射DATS 30 mg·kg－1一次;④生理鹽水對照組，每天腹腔注射與DATS等體積生理鹽水1次，連續(xù)注射7 d。各組動物(n=6)于注射LPS后2 h、6 h脫頸處死。留取左肺，測定肺組織濕/干重。將右肺中葉固定于4%多聚甲醛溶液中，用免疫組化法檢測ICAM-1。再將生理鹽水灌洗剩余的右肺，濾紙吸干，即刻保存于－70℃液氮中，用于測定肺組織MPO、MDA、SOD、T-AOC。

1.2 肺系數(shù)、肺組織濕/干重比的測定 實驗結束時準確稱量小鼠體重。各組動物于2 h、6 h脫頸處死，迅速開胸取肺臟，吸干表面血污后，稱重。再取左肺，濾紙吸干表面水份，稱肺濕重(W)，計算肺系數(shù)(肺系數(shù)/%=肺重量/體重×100%)。再將肺組織置于80℃烤箱內(nèi)烘干72 h至完全脫水，稱量肺干重(D)并計算肺濕干重比(W/D)以估計各組肺組織水腫程度。

1.3 MPO、MDA、SOD 和 T-AOC測定 試劑盒購自南京建成生物醫(yī)學工程研究所，按試劑盒操作說明書進行。

1.4 肺組織ICAM-1測定及半定量分析 采用免疫組織化學法檢測ICAM-1表達情況。石蠟包埋肺組織切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，0.01 mol·L－1PBS洗3 min×2次。3%過氧化氫室溫孵育10 min消除內(nèi)源性辣根過氧化物酶活性?？乖迯秃笥梅忾]液室溫孵育1 h，洗滌后滴加一抗(兔抗鼠ICAM-1單克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司)，37℃孵育2 h，PBS沖洗3遍。親和素標記的二抗室溫孵育2 h，PBS沖洗3遍，辣根過氧化物酶標記的卵親蛋白－親和素復合物室溫孵育1 h，PBS沖洗4遍，每次5 min，DAB顯色。梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹脂封片。利用HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學圖像分析軟件進行分析，以平均光密度為指標，每個時間點每組隨機抽取不同切片5張，每張切片于光鏡下(10×40)隨機選取5個視野，測定平均光密度值取平均值，反映ICAM-1的表達強度。

1.5 統(tǒng)計學分析 用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)用±s表示，多組均數(shù)比較行單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較用最小顯著差法(least significant difference，LSD);兩組均數(shù)比較行獨立樣本t檢驗(independent-samplesttest)。

Tab 1Effect of DATS on lung coefficient and pulmonary W/D in different groups(±s，n=6)

Tab 1Effect of DATS on lung coefficient and pulmonary W/D in different groups(±s，n=6)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs ALI group

Group Lung coefficient/%2 h 6 h Pulmonary W/D 2 h 6 h Control 0.63 ±0.10 0.68 ±0.09 4.053 ±0.344 4.072 ±0.550 ALI 0.69 ±0.09 0.84 ±0.11* 4.258 ±0.238 4.801 ±0.375*DATS treatment 0.72 ±0.10 0.79 ±0.15* 4.231 ±0.236 4.795 ±0.299*DATS pretreatment 0.67 ±0.12 0.72 ±0.10# 4.134 ±0.336 4.352 ±0.239#

2 結果

2.1 肺系數(shù)及肺W/D的變化 ALI組，2 h肺系數(shù)、肺W/D較對照組無明顯變化，6 h肺系數(shù)、肺W/D較對照組升高(P＜0.05)，表明出現(xiàn)肺水腫。6 h時，DATS預防組肺系數(shù)、肺W/D與ALI組相比下降(P＜0.05)，表明肺水腫有所減輕。但DATS治療組與ALI組相比肺系數(shù)、肺W/D無明顯改善(P＞0.05)。見 Tab 1。

2.2 肺組織勻漿中反映氧化損傷和抗氧化指標的變化 注射LPS后2 h、6 h，ALI組小鼠肺組織勻漿中MPO活性、MDA含量均明顯高于對照組(P＜0.05)，SOD活性和T-AOC活性則明顯低于對照組(P＜0.05)。預防性給予DATS與ALI組相比較，MPO活性、MDA含量明顯降低(P＜0.05)，而SOD活性及T-AOC活性明顯升高(P＜0.05)，DATS治療組與ALI組相比，4項指標差異均無顯著性(P＞0.05)，見 Tab 2。

2.3 肺組織ICAM-1的表達變化 對照組肺組織ICAM-1表達大部分位于氣道粘膜上皮細胞，只有少數(shù)血管內(nèi)皮細胞呈棕黃色的陽性著色分布，染色較淺淡，陽性信號較弱。ALI組小鼠在注射LPS后2 h及6 h，肺組織ICAM-1陽性細胞分布明顯增多，在氣道粘膜上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞均可見深黃色陽性表達，且染色程度加深。DATS預防組的ICAM-1陽性表達介于LPS組和對照之間。圖像分析證明，ALI組ICAM-1的平均光密度較對照組升高(P＜0.05)，DATS預防組ICAM-1的平均光密度較ALI組降低(P＜0.05)，DATS治療組較ALI組差異無顯著性(P＞0.05)。見 Fig 1、2，Tab 2。

Tab 2The MPO，SOD，T-AOC activity，MDA content and ICAM-1 expression in the lung tissue in different groups(±s，n=6)

Tab 2The MPO，SOD，T-AOC activity，MDA content and ICAM-1 expression in the lung tissue in different groups(±s，n=6)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs ALI group

Group 2 h MPO/U·g－1 MDA/μmol·g－1 Pro SOD/kU·g－1 Pro T-AOC/U·g－1 Pro ICAM-1(OD)6 h MPO/U·g－1 MDA/μmol·g－1 Pro SOD/kU·g－1 Pro T-AOC/U·g－1 Pro ICAM-1(OD)Control 0.84 ±0.11 1.83 ±0.20 385.89 ±6.58 1.46 ±0.21 0.23 ±0.06 1.06 ±0.13 1.92 ±0.25 389.42±9.26 1.61±0.17 0.27 ±0.031 ALI 2.29 ±0.17* 2.25 ±0.18* 373.42 ±7.72*1.14 ±0.14* 0.26 ±0.04* 3.30 ±0.10* 2.69 ±0.19* 368.04 ±9.13*0.98 ±0.18* 0.30 ±0.05*DATS treatment 2.17 ±0.14 2.20 ±0.24 373.86 ±8.67 1.16 ±0.22 0.26 ±0.03 3.25 ±0.17 2.70 ±0.12 370.02 ±8.44 1.03 ±0.15 0.29 ±0.03 DATS pretreatment 1.91 ±0.10# 2.02 ±0.15# 380.05 ±7.21#1.37 ±0.19# 0.24 ±0.04# 2.88 ±0.15# 2.57 ±0.31# 374.65 ±5.67#1.49 ±0.21# 0.28 ±0.06#

3 討論

本研究結果表明，給小鼠腹腔注射LPS后6 h肺系數(shù)、肺組織W/D較對照組升高，表明出現(xiàn)了明顯的肺水腫，證實ALI模型復制成功。預防性應用DATS可降低肺系數(shù)及肺組織W/D，說明DATS減輕了ALI的肺水腫程度。這種作用是否與其抗氧化作用有關呢?我們進一步觀察了氧化應激指標的變化。

ALI時，多形核中性粒細胞(polymorphonuclear leucocyte，PMN)在肺部被激活后處于“呼吸爆發(fā)”狀態(tài)，耗氧量大增，產(chǎn)生過量的氧自由基，參與ALI的發(fā)生［7］。MPO是中性粒細胞嗜天青顆粒所釋放的過氧化物酶類，其活性的高低與PMN的數(shù)量成正比，是 PMN 積聚的指標［8－9］。本實驗結果表明，注射LPS后2、6 h小鼠肺組織MPO活性較對照組明顯增高，反映了PMN在肺內(nèi)的大量扣押和積聚。

Fig 1 The expression of ICAM-1 in lung tissues at 2 h after LPS injection(400×)

ALI時PMN在肺內(nèi)扣押，主要是由于LPS激活了肺血管內(nèi)皮細胞，使其表面的黏附分子ICAM-1表達增加，導致內(nèi)皮細胞與PMN的黏附性增強，使PMN易于通過血管壁參與局部炎癥反應。我們同時也觀察到，注射LPS后2、6 h，ICAM-1在肺組織的表達明顯增加，并且不僅局限于氣道粘膜上皮細胞，在血管內(nèi)皮細胞表達增加更為明顯，表明ICAM-1參與了肺組織炎癥和肺水腫的發(fā)生。ICAM-1的表達水平與肺損傷程度密切相關［10］，可作為檢測血管內(nèi)皮細胞活化損傷的標志物，預測ALI的嚴重程度［11］。本實驗觀察到，預防性應用DATS可使ALI小鼠肺組織中 ICAM-1的表達受到抑制，尤其是肺血管內(nèi)皮細胞的陽性信號減弱明顯，MPO的活性也明顯降低。說明DATS可通過抑制ICAM-1的表達減少PMN與血管內(nèi)皮細胞的黏附，減少PMN等炎癥細胞在肺組織的扣押，由此減少氧自由基的產(chǎn)生，從而減輕肺損傷。

Fig 2 The expression of ICAM-1 in lung tissues at 6 h after LPS injection(400×)

ALI時過量的氧自由基不僅來源于PMN的“呼吸爆發(fā)”，同時也和機體抗氧化機制障礙有關。SOD是氧自由基的清除劑，是機體抗氧化體系中一個重要的酶［12］，其活力高低間接反映機體清除氧自由基的能力。T-AOC是機體清除自由基的重要指標，它的測定結果克服了單一的抗氧化指標難以全面反映組織抗氧化能力的不足［13］。本實驗中，ALI組小鼠肺組織SOD和T-AOC的活性均明顯減低，表明機體總的抗氧化能力下降，清除氧自由基減少;而應用DATS可使SOD活性及T-AOC活性有所恢復，表明其可增強機體的抗氧化能力。此外，肺組織MDA的含量在ALI小鼠明顯增加，反映了肺組織脂質(zhì)過氧化損傷程度加重。MDA是氧自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸所形成的脂質(zhì)過氧化物，它的增加表明器官組織內(nèi)存在脂質(zhì)過氧化損傷的程度。ALI時SOD活性下降和MDA含量升高反映了機體氧化/抗氧化平衡的失調(diào)，預防性應用DATS可升高SOD活性降低MDA含量，糾正這種氧化/抗氧化的失衡，對機體起到保護作用。

綜上，預防性應用DATS可在一定程度上減輕肺組織的氧化應激反應以及ICAM-1的表達，從而發(fā)揮抗ALI作用。

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