核黃素四丁酸酯抗焦慮作用的藥效學研究

于文瀟，趙 德，鄧 君

(1.西南大學藥學院，重慶 400716;2.北大國際醫(yī)院集團重慶大新藥業(yè)股份有限公司，重慶 400700)

焦慮癥是一種常見的精神類疾病，隨著社會壓力的日趨激烈，其發(fā)病率逐年升高［1］。目前臨床常用的抗焦慮和抗抑郁藥物有諸多不良反應，如:頭昏、停藥后復發(fā)、認知障礙、藥物依賴等［2］，因此研發(fā)療效好、針對性強、副作用少的抗焦慮和抗抑郁藥物成為近年的研究熱點［3］。

有報道稱維生素等營養(yǎng)物質(zhì)的匱乏可能導致焦慮抑郁等精神疾病，因此在相應的藥物治療中添加維生素(尤其是復合維生素B族)，可達到更佳的治療效果［4］。研究表明，維生素 B2對產(chǎn)后抑郁癥有一定療效［5］，維生素B2還可加強三環(huán)類抗抑郁藥治療伴有認知功能障礙的老年抑郁癥［6］。

核黃素四丁酸酯(RTB)是維生素B2的衍生物，一直被用作降血脂藥物(維脈寧)，具有抑制血小板聚集和增加纖維蛋白溶解活性的作用，用于高血脂、冠心病和血栓性疾病的治療［7］。RTB對精神疾病的藥理活性尚未見報道，本文采用行為藥理學的實驗方法初步考察RTB的抗焦慮藥理作用。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級昆明種小鼠，♂，8周齡，體重18～24 g，購買于第三軍醫(yī)大學實驗動物中心。自由攝食飲水。光照節(jié)律12L:12D(7:00～19:00)，室溫(25±2)℃。環(huán)境安靜。每只動物只用1次。

1.2 藥物與試劑 ① RTB:由重慶大新藥業(yè)股份有限公司提供;臨用前用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液混懸均勻，避光保存。②地西泮靜脈注射液:SWJ?，湖北制藥有限公司，批號09070001;用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液稀釋成所需濃度，新鮮配制，4℃保存。③ 鹽酸丁螺環(huán)酮片，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號:20100202。配制方法同上。④羧甲基纖維素鈉:成都科龍化工試劑廠，批號:20090402。

1.3 主要儀器 高架十字迷宮(elevated plusmaze，EPM):兩個開臂(長30 cm，寬5 cm)與兩個閉臂(長30 cm，寬5 cm，高15 cm)相互垂直，中央平臺5 cm×5 cm。迷宮距離地面50 cm。PM-200十字迷宮跟蹤分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限責任公司。YLS-4C型轉(zhuǎn)棒式疲勞儀，山東省醫(yī)學科學院設備站。

2 方法

2.1 動物分組 動物適應飼養(yǎng)3 d，按體重隨機分為RTB高、中、低劑量組、地西泮組、丁螺環(huán)酮組和空白組。EPM實驗和新型食物消耗實驗，每組動物15只;轉(zhuǎn)棒實驗，每組動物10只。

2.2 給藥方式 一次性灌胃給藥。按照人與動物的體表面積計算法換算出RTB高、中、低劑量組分別為 80、40、20 mg·kg－1，約相當于人給藥劑量 10、5、2.5 mg·kg－1;地西泮按 2 mg·kg－1給藥，丁螺環(huán)酮按5 mg·kg－1給藥;空白組灌服等容積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。RTB組、丁螺環(huán)酮組和空白組給藥1 h后，地西泮組給藥0.5 h后，進行行為學測試，測試時間為9:00～15:30。

2.3 小鼠高架十字迷宮實驗［8］所有動物提前2 h進入測試實驗室。測試前將每只小鼠放入1個60 cm×60 cm×35 cm塑料盒中，自由探究5 min，然后迅速置于EPM的中央平臺，頭朝一開臂，放開，由跟蹤分析系統(tǒng)自動記錄5 min內(nèi)小鼠分別進入開臂的次數(shù)(open arm entry，OE，以小鼠4只爪子均進入到臂內(nèi)為準)和進入閉臂的次數(shù)(close arm entry，CE，同上)以及分別在開臂內(nèi)的滯留時間(open arm time，OT，單位:s)和在閉臂內(nèi)的滯留時間(close arm time，CT，單位:s)，計算出:① 進入開臂和閉臂的總次數(shù)(OE+CE)，作為小鼠運動活力(locomotor activity)的評價指標;② 開臂進入次數(shù)百分比(OE%)，即OE/(OE+CE)×100%;③ 開臂滯留時間百分比(OT%)，即 OT/(OT+CT)×100%［9］;OE%和OT%作為抗焦慮作用的指標。每只小鼠測試完畢后用酒精擦拭迷宮，排除氣味對下只小鼠的干擾。

2.4 小鼠新型食物消耗實驗(novel food consumption test)［10］實驗前所有小鼠禁食16 h。給藥一定時間后，每只小鼠置于一干燥潔凈的塑料盒(24 cm×10 cm×8 cm)中。每個盒中同一位置放入一直徑9 cm的表面皿，內(nèi)盛定量新型食物(鼠料粉∶色拉油=2∶1)。記錄每只小鼠5 min內(nèi)的食物消耗量，計算小鼠每克體重消耗食物的量，以mg·g－1表示。

2.5 轉(zhuǎn)棒實驗(rota-rod test)［11］實驗前1 d訓練所有實驗動物，能在轉(zhuǎn)桿上停留5 min的動物進入第2天的測試，排除不達標者。實驗時將小鼠放于直徑7 cm的轉(zhuǎn)桿上，轉(zhuǎn)速為10 r·min－1。分別在給藥1 h、3 h、6 h和24 h后將小鼠置于轉(zhuǎn)桿上，記錄各組小鼠在1 min內(nèi)的跌落只數(shù)，計算成功率(成功率/%=未跌落小鼠數(shù)/每組小鼠總數(shù)×100%)。

3 結果

3.1 小鼠高架十字迷宮實驗 EPM實驗結果(Tab 1)表明，與空白對照組比較，各給藥組的總入臂次數(shù)(OE+CE)沒有明顯變化，提示各組藥物均未改變動物的活動能力。地西泮和丁螺環(huán)酮組均明顯地增加小鼠OE%和OT%值。RTB各劑量組的OE%和OT%值均較空白組增加，且20和40 mg·kg－1組與空白組比較差異有顯著性，說明低劑量和中劑量RTB在EPM模型上顯示出抗焦慮作用。

Tab 1 Effect of RTB on the behavior of mice in EPM(± s，n=15)

Tab 1 Effect of RTB on the behavior of mice in EPM(± s，n=15)

DZP:diazepam;RTB:riboflavin tetrabutyrate;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control

Group Dose/mg·kg－1OE+CE OE% OT%Control － 12.06±8.05 34.42 ±17.24 34.77±18.90 DZP 2 15.26±11.02 50.50 ±15.83＊＊ 59.11±20.65＊＊Buspirone 5 11.00±6.96 48.07 ±19.96* 49.47±22.20 RTB 20 13.40±4.87 46.71 ±16.15* 49.62±17.51*40 13.53±4.32 49.60 ±16.44* 50.18±18.53*80 12.86±8.01 42.26 ±12.88 41.00±11.56

3.2 小鼠新型食物消耗實驗 結果(Tab 2)顯示，地西泮能增加小鼠在新奇環(huán)境中對新型食物的消耗量，但丁螺環(huán)酮對小鼠新型食物消耗量的增加未達到統(tǒng)計學意義。RTB各劑量組小鼠單位體重的食物消耗量均較空白組增加，且40和80 mg·kg－1組與空白組比較差異有顯著性(P＜0.05)，即在小鼠新型食物消耗實驗中，RTB在中劑量和高劑量時表現(xiàn)出抗焦慮作用。

3.3 小鼠轉(zhuǎn)棒實驗 結果(Tab3)顯示，與空白組比較，地西泮和丁螺環(huán)酮導致小鼠從轉(zhuǎn)棒上的跌落率增加，提示地西泮和丁螺環(huán)酮對受試動物的運動協(xié)調(diào)性有損傷。而RTB各組小鼠的跌落率沒有明顯變化，說明RTB在所給劑量下單次給藥，對小鼠的肌肉協(xié)調(diào)能力沒有明顯損害作用。

Group Dose/mg·kg－1 Consumption of novel food/mg·kg －1 Control － 6.78 ±2.73 DZP 2 10.42 ±4.30＊＊Buspirone 5 8.55 ±2.89 RTB 20 8.26 ±4.48 40 10.20 ±2.94*80 9.93 ±4.11*

DZP:diazepam;RTB:riboflavin tetrabutyrate;*P＜0.05，＊＊P＜0.01vscontrol

Tab 3 Effect of RTB on the rate of falling from rota-rod of the mice(n=10)

4 討論

EPM為國際公認的測試動物焦慮行為的首選模型，它利用動物對新奇環(huán)境的探究習性與對高懸敞開臂的恐懼，形成動物的矛盾沖突心理，通過動物的行為表現(xiàn)考察動物的焦慮情緒［12］。OE%和OT%反映了動物趨近－規(guī)避沖突的結果，與焦慮程度直接相關，抗焦慮藥物可以使OE%和OT%增高;而開臂和閉臂的總進入次數(shù)反映了動物的活動能力。新型食物消耗實驗也是篩選抗焦慮藥物的經(jīng)典行為藥理學模型，利用動物在新奇環(huán)境中的逃避心理和對誘人食物的享用欲望形成矛盾沖突，使動物產(chǎn)生焦慮情緒?？菇箲]作用的藥物可以翻轉(zhuǎn)陌生環(huán)境對攝食行為的抑制，縮短動物對新型食物消耗的潛伏期及增加對食物的消耗量［13］。

EPM實驗中，RTB各劑量組小鼠的活動能力無明顯改變，但OE%和OT%均較空白組增加，且20和40 mg·kg－1劑量組差異有顯著性，但作用不如地西泮。新型食物消耗實驗中，RTB 40和80 mg·kg－1劑量能明顯增加動物單位體重的食物消耗量。上述結果均表明，RTB具有抗焦慮作用，且在40 mg·kg－1劑量下抗焦慮效果最優(yōu)。

上述實驗結果中，苯二氮卓類抗焦慮藥物地西泮的抗焦慮效果最優(yōu)，但轉(zhuǎn)棒實驗中其對動物的肌肉協(xié)調(diào)能力損害最大;5-HT1A受體激動劑的代表藥物丁螺環(huán)酮的抗焦慮效果不如地西泮，可能因為其作用效果緩慢且需要多次用藥［14］，而本研究中采用單次給藥且用藥時間短，導致其未完全發(fā)揮出抗焦慮作用。RTB雖然抗焦慮作用不及地西泮，但對受試動物的肌肉協(xié)調(diào)能力無明顯損傷，且該藥物在降血脂應用中未表現(xiàn)出明顯毒副作用，有望成為一種安全的新型抗焦慮藥物。

RTB的抗焦慮機制可能是通過其前體化合物核黃素(維生素B2，Vit B2)起作用。Vit B2是黃素蛋白的輔酶FMN和FAD的核心組成成分，是重要的電子傳遞體，參與細胞呼吸過程，且為其他多種細胞過程所需［15］。Vit B2還影響其他維生素的作用，如Vit B6轉(zhuǎn)化為其活性形式磷酸吡哆醛就必需Vit B2的參與。而磷酸吡哆醛是多種神經(jīng)遞質(zhì)體內(nèi)合成關鍵酶的輔酶，如催化色氨酸合成5-羥色胺(5-HT)的色氨酸脫羧酶、催化谷氨酸鹽轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸(γ-GABA)的L-谷氨酸脫羧酶等均以磷酸吡哆醛為輔酶［16］，故 Vit B2對于維持抑制性神經(jīng)遞質(zhì)——5-HT、GABA的正常水平是必需的。此外，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NA)的代謝失活需要單胺氧化酶(MAO)，而MAO是黃素蛋白酶，其催化活性需要Vit B2的直接作用［17］。所以，Vit B2是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮正常功能的保證，其缺乏會導致精神緊張，甚至出現(xiàn)認知障礙、神經(jīng)退行性病變和周圍神經(jīng)病［18］。Carney 等［19］發(fā)現(xiàn)，Vit B2的缺乏與精神疾病明顯相關。

Vit B2是水溶性維生素，可隨尿液和汗液排泄，故需每日補充。正是因為Vit B2的強親水性，使其不能被動擴散通過細胞膜進入細胞，而需要轉(zhuǎn)運蛋白的主動運輸［20］。而主動運輸與轉(zhuǎn)運蛋白的量和活性成正相關，是可飽和的，故對那些轉(zhuǎn)運蛋白表達量不足或活性較低的人群，即使補充Vit B2，也容易導致Vit B2缺乏。而RTB是Vit B2的酯化衍生物，具強脂溶性，可能不需要通過轉(zhuǎn)運蛋白直接依賴濃度差擴散進入細胞，尤其是神經(jīng)細胞，形成細胞的Vit B2庫，保證細胞對Vit B2的需求，維持細胞的最佳生理狀態(tài)。所以，RTB至少可以作為Vit B2的前體藥物，發(fā)揮預防焦慮和緩解焦慮癥狀的作用，而且對于核黃素轉(zhuǎn)運蛋白表達低或活性低的群體，其對焦慮癥的緩解作用大于Vit B2。

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