土槿乙酸抑制人卵巢癌SKOV3細胞增殖并誘導G2/M期阻滯

買 霞，徐忠偉，陳小義，徐瑞成

(1.中國人民武裝警察部隊后勤學院基礎部細胞生物學與醫(yī)學遺傳學教研室;2.天津市職業(yè)和環(huán)境危害生物標志物重點實驗室，天津 300162)

土槿乙酸(pseudolaric acid-B，PLAB)是從我國松科植物金錢松的根皮及近根皮中分離出來的二萜類化合物，藥理作用廣泛。近來研究表明［1－3］，PLAB可以抑制胃癌MGC-803、乳腺癌MCF-7和前列腺癌PC-3等多種腫瘤細胞的增殖并誘導細胞凋亡，其抗腫瘤作用多與細胞G2/M期阻滯相關。研究發(fā)現［2］，PLAB作用于MCF-7細胞時，細胞阻滯于G2/M期，細胞周期蛋白Cyclin B1和CDK1呈高表達狀態(tài)。本實驗觀察PLAB對人卵巢癌SKOV3細胞周期的影響及其與細胞周期相關蛋白之間的關系，為闡明PLAB抗癌作用機制積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人卵巢癌細胞株SKOV3購自中科院上海生命科學研究院細胞庫，土槿乙酸由天津武警后勤學院生藥教研室提供，無水乙醇溶解成母液，濃度為 1 mmol·L－1，－20℃避光保存，使用時用細胞培養(yǎng)液稀釋至終濃度，培養(yǎng)液中無水乙醇終濃度低于0.1%。H-DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產品。胎牛血清由中國醫(yī)學科學院血研所提供。TRIzol試劑由Invitrogen公司生產;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Hoechst 33342、碘化丙啶(PI)和二甲基亞砜(DMSO)為Sigma公司產品;PrimeScriptTMRT逆轉錄試劑為大連TaKaRa公司產品;一抗兔抗人Cyclin B1、CDK1和Cyclin D1多克隆抗體均購Abcam公司，二抗購自KPL公司，ECL化學發(fā)光試劑購自Millipore公司。

1.2 細胞增殖抑制檢測(MTT法) 調整細胞密度為4×104·L－1，接種于96孔板，每孔加細胞懸液100 μl，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后作藥物處理，實驗組PLAB(終濃度分別為 10、5、1、0.5、0.1 μmol·L－1)，同時設對照組(不加藥)和空白組(只加培養(yǎng)基)，每組設6個復孔，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h，加 MTT 20 μl，4 h 后加入 DMSO 200 μl，避光振蕩10 min，全自動酶標儀570 nm處測定各孔吸光度(A值)。

1.3 Hoechst 33342熒光染色檢測細胞死亡特征5 μmol·L－1PLAB 作用細胞 12 和 24 h 后收集細胞，Hoechst 33342熒光染色，熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，照相記錄。

1.4 流式細胞術檢測細胞周期［4］0.5、1和5 μmol·L－1PLAB作用細胞12和24 h后，分別收集細胞，PBS洗2次，體積分數為0.75冷乙醇固定，上機前棄乙醇，PBS洗1次，加入 RNase 100 mg·L－1，和5 g·L－1碘化乙啶(PI)染色劑，避光染色20 min，流式細胞儀檢測細胞周期分布。

1.5 RNA提取和Real time-PCR檢測Cyclin B1和CDK1 mRNA表達 5 μmol·L－1PLAB作用細胞12和24 h后，收集細胞，TRIzol法提取細胞總RNA，按 PrimeScriptTMRT試劑盒操作合成 cDNA。引物序列見Tab 1，Real time-PCR反應體系為20 μl(上游引物 1 μl，下游引物 1 μl，cDNA 2 μl，SYBR green PCR master mix 4 μl，ddH2O 12 μl)。擴增條件95℃變性10 min:94℃變性5 s，65℃退火 15 s，72℃延伸15 s，共45個循環(huán):熒光檢測分析擴增曲線和溶解曲線，反應冷卻至40℃。實驗獨立重復3次。根據Roche 1.5檢測系統(tǒng)提供Cp(Crossing Point)值，△Cp=CpGene－CpGAPDH，△△Cp=△Cptreated－ △Cpcontrol，通過相對定量法(2－△△Ct)，計算各基因mRNA表達。

1.6 Western blot法檢測 Cyclin B1、CDK1 和 Cyclin D1蛋白表達 5 μmol·L－1PLAB作用細胞12和24 h后，收集細胞，預冷PBS溶液洗細胞2次，每孔加入100 μl細胞裂解液［含 50 mmol·L－1Tris-HCl(pH 8.3)、150 mmol·L－1NaCl、0.02% 十二烷基硫酸鈉、1%NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉、0.1%原礬酸鈉、100 μmol·L－1苯甲基磺酰氟溶液］，用細胞刮將細胞刮下，冰上裂解30 min，4℃低溫離心(15 min，12 000 r·min－1)，吸取上清。樣品采用 BCA法蛋白定量，上樣60 μg蛋白，進行SDS-PAGE，轉移至聚氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入1∶1 000稀釋的兔抗人Cyclin B1、CDK1和Cyclin D1多克隆抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜后，加入1∶3 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌，經ECL液化學發(fā)光，暗室X線片曝光，顯影定影。用BandScan 5.0軟件進行A值分析。

Tab 1 Sequences of PCR primers

Tab 2 Inhibitory effect of PLAB in SKOV3cell proliferation of each group at different time points(A，±s，n=6)

Tab 2 Inhibitory effect of PLAB in SKOV3cell proliferation of each group at different time points(A，±s，n=6)

The PLAB groups were different significantly compared with control group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

PLAB final concentration/μmol·L －1 Time/h 24 48 72 0 1.3202 ±0.0859 2.6002 ±0.1623 2.2777 ±0.1094 100.5675 ±0.0211＊＊ 0.7218 ±0.0403＊＊ 0.5218 ±0.0301＊＊5 0.6113 ±0.0489＊＊ 0.7697 ±0.0273＊＊ 0.6190 ±0.0111＊＊1 0.7693 ±0.0286＊＊ 1.1752 ±0.1009＊＊ 1.0252 ±0.0782＊＊0.5 1.0248 ±0.0854* 2.2157 ±0.0528* 2.2615 ±0.0835 0.1 1.241 ±0.0729* 2.3080 ±0.1173*2.311 ±0.0856

2 結果

2.1 土槿乙酸對SKOV3細胞增殖抑制作用 SKOV3細胞經 PLAB(終濃度為 10、5、1、0.5、0.1 μmol·L－1)處理后，均受到不同程度的抑制，并呈時間及劑量依賴性，其中藥物作用24、48和72 h的IC50值分別為 2.44、1.60、2.94 μmol·L－1(Tab 2)。

2.2 土槿乙酸可誘發(fā)SKOV3細胞凋亡 經熒光染色后可見對照組細胞形態(tài)規(guī)整，核較大，核染色質均勻，被Hoechst 33342染成藍色均勻一致熒光(Fig 1A)。5 μmol·L－1PLAB 處理的 SKOV3細胞可見規(guī)律性的變化，即作用12、24 h后部分細胞呈現形態(tài)不規(guī)則，核染色質凝集，核膜破裂等凋亡細胞形態(tài)(Fig 1B，1C)。

2.3 SKOV3細胞周期變化 PLAB(終濃度分別為0.5、1、5 μmol·L－1)作用于 SKOV3細胞 12 和 24 h后流式細胞術分析細胞周期結果顯示(Fig 2)，對照組G2/M期細胞比例分別為12.5%和15%;0.5、1、5 μmol·L－1PLAB 作用于 SKOV3細胞 12 h，G2/M期細胞比例分別為18.4%、40.3%、52.4%;作用24 h G2/M期細胞比例分別為29.3%、42.5%、53.9%，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。由此可見，隨著PLAB濃度升高，G2/M期細胞比例明顯增大并表現出時間依賴性，這說明PLAB可將SKOV3細胞阻滯于G2/M期。

2.4 SKOV3細胞Cyclin B1和CDK1 mRNA表達

通過相對定量法(2－△△Ct)計算各實驗組 SKOV3細胞的相關基因表達(Tab 3)，5 μmol·L－1PLAB 作用SKOV3細胞12和24 h兩個檢測點中，Cyclin B1基因水平分別是對照組的1和50.75倍;CDK1基因水平分別是對照組的84.94和209.94倍;結果顯示5 μmol·L－1PLAB 阻滯于 G2/M 時 Cyclin B1、CDK1呈高表達狀態(tài)(P＜0.05)。

2.5 SKOV3細胞 Cyclin B1、CDK1 和 Cyclin D1蛋白表達 Western blot結果顯示(Fig 3)，與對照組細胞相比，5 μmol·L－1PLAB 作用 SKOV3細胞 12、24 h后，細胞于G2/M阻滯的同時，可見細胞周期Cyclin B1、CDK1蛋白呈高表達狀態(tài)，Cyclin D1蛋白呈低表達狀態(tài)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，尤其以作用24 h處理組更為明顯(P＜0.01)。

Fig 1 Morphologic changes of SKOV3cells treated with 5 μmol·L －1PLAB at different time points by fluorescence microscope(× 100)

Fig 2 Flow cytometric analysis of the cell cycle distribution in SKOV3cells of PLAB treatment at different time points

3 討論

土槿乙酸的藥理學研究及體內外實驗均證實PLAB具有廣泛的抗腫瘤活性，選擇性抑制腫瘤細胞的生長，對正常細胞生長無影響［5－6］，活體無明顯毒性。實驗采用不同濃度PLAB作用于SKOV3細胞，MTT結果顯示PLAB能抑制SKOV3細胞的生長，且抑制作用呈時間－濃度依賴性。

Tab 3 The Cyclin B1 and CDK1 mRNA levels of SKOV3cells treated with 5 μmol·L －1PLAB for different time by Real time-PCR(±s)

Tab 3 The Cyclin B1 and CDK1 mRNA levels of SKOV3cells treated with 5 μmol·L －1PLAB for different time by Real time-PCR(±s)

The PLAB groups were different significantly compared with control group，*P ＜0.05

Gene Relative amount(2－△△Ct)Exposure time/h 0 12 24 Cyclin B1 0.24 ±0.07 0.48 ±0.06 12.18 ±3.21*CDK1 0.03 ±0.02 2.82 ±0.21* 6.97 ±0.74*

文獻報道，卵巢癌占女性惡性腫瘤的4%，是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，其5年生存率在早期患者為90%，晚期患者則不足30%［7］。研究表明在卵巢細胞發(fā)生惡性轉化過程中，除了癌基因/抑癌基因正負調節(jié)失控外，細胞周期蛋白(Cyclins)也是參與卵巢細胞癌變過程的重要調控因子，其中Cyclin B1是與細胞G2/M檢測點有關的重要細胞周期調控因子。生理情況下，體內外信號激活Cyclin B1后，Cyclin B1在S期開始合成并在G2期定位于細胞胞質，Cyclin B1的濃度在細胞內達到臨界域值后結合CDK1并磷酸化CDK1Thr160/Thr161，形成異源二聚體Cyclin B1/CDK1，即細胞成熟促進因子(maturation promoting factor，MPF)，進細胞從G2期進入M期，啟動細胞有絲分裂［8］。Yu 等［9］證實 PLAB 可以增加核內Cyclin B1的表達，提高Cyclin B1從胞質向核內轉運，并阻止核內的Cyclin B1降解，而核內Cyclin B1上調是M期周期阻滯的標志。Welsh等［10］應用寡核苷酸芯片在卵巢癌組織及SKOV3細胞系中檢測到Cyclin B1和CDK1的高表達，Cyclin B1的過表達導致G2/M期關卡失控，使本來應停止增殖或生理性凋亡的細胞不停地進入細胞周期，因而造成惡性增殖，說明Cyclin B1有可能參與卵巢腫瘤發(fā)生及惡性進展。

Fig 3 The Cyclin B1，CDK1 and Cyclin D1 expression levels of SKOV3cells treated with 5 μmol·L －1PLAB for different time by Western blot

本實驗結果證實:PLAB作用于SKOV3細胞后，隨著藥物濃度的升高和作用時間的延長，細胞G2/M期細胞比例明顯升高。Western blot結果顯示，5 μmol·L－1PLAB處理SKOV3細胞，隨著時間進程，Cyclin B1和CDK1表達均上調，Cyclin D1表達下調。課題組推測PLAB引起SKOV3細胞Cyclin B1和CDK1表達升高，引發(fā)細胞內MPF分子的不斷積聚，致大量處于S期時相的細胞進入G2/M期，同時缺乏介導處于G2/M期時相進入G0/G1期的Cyclin D1，因此，發(fā)生細胞周期G2/M期阻滯現象。是否PLAB阻止Cyclin B1降解從而使細胞阻滯于G2/M期尚需進一步研究。

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