β-抑制蛋白在AT1受體信號(hào)通路中的作用及意義

魏 凱，徐添穎，管云楓，繆朝玉

(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海 200433)

血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是腎素－血管緊張素系統(tǒng)的最重要的活性物質(zhì)。AngⅡ通過(guò)與其主要受體血管緊張素Ⅱ一型受體(angiotensinⅡ t ype 1 receptor，AT1受體)結(jié)合，在病理生理?xiàng)l件下，形成廣泛的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，參與心血管活動(dòng)的調(diào)節(jié)，如血管收縮、血管與心肌重構(gòu)等。作為心血管系統(tǒng)最重要的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)之一，AT1受體接受AngⅡ刺激后，能與多種G蛋白偶聯(lián)，如Gq/11、G12/13、Gi蛋白，并激活下游的磷脂酶C、A2 和 D［1］，傳 統(tǒng) 認(rèn) 為 G q/11-PLC-IP3/DAG-Ca2+/PKC 通 路(Fig 1)是細(xì)胞內(nèi)AT1受體下游信號(hào)網(wǎng)絡(luò)形成的基礎(chǔ)。AngⅡ還可激活胞內(nèi)多條激酶系統(tǒng)［2］，如促分裂原活化蛋白激酶通路(mitogenic activated protein kinase pathway，MAPK 通路)，包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、c-Jun 氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNKs)和p38MAPK;以及受體與非受體酪氨酸激酶通路，如表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、Src激酶家族成員等。AngⅡ還可激活多種小分子量GTP結(jié)合蛋白，如Ras、Rho和Rab家族部分成員。

β-抑制蛋白(β-arrestins，βArrs)屬于Arrsestin家族，Arrsestin家族包括 a rrestin1、arrestin2(βArr1)、arrestin3(βArr2)和arrestin4，其中βArr1和βArr2廣泛表達(dá)。以往認(rèn)為βArrs主要參與GPCRs的脫敏、內(nèi)化等負(fù)反饋調(diào)節(jié)，最近研究表明，βArrs還可作為支架蛋白，參與GPCRs的非G蛋白信號(hào)的形成。βArrs對(duì)AT1受體的調(diào)節(jié)也涉及上述兩個(gè)方面，目前AT1受體下游信號(hào)網(wǎng)絡(luò)分為Gq/11依賴的和非Gq/11依賴(βArrs依賴)的兩條通路。內(nèi)源性配體AngⅡ可同時(shí)激活Gq/11依賴和 βArrs依賴的兩條信號(hào)通路，沒(méi)有選擇性，是AT1受體的完全激動(dòng)劑。而某些外源性配體如SⅡ(AngⅡ的1、4、8位三取代衍生物)可選擇性激活 βArrs依賴的通路，是AT1受體的偏向性激動(dòng)劑［3］。多項(xiàng)基于細(xì)胞的蛋白－蛋白相互作用組學(xué)和蛋白磷酸化組學(xué)的研究分析了AngⅡ和SⅡ誘導(dǎo)的AT1受體下游的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果表明多達(dá)337種胞內(nèi)蛋白與βArr1或βArr2相互作用［4］;224個(gè)蛋白的磷酸化水平受到SⅡ的調(diào)節(jié)［5］;1183個(gè)磷酸化位點(diǎn)受到AngⅡ或SⅡ的調(diào)節(jié)［6］。可見(jiàn)，βArrs廣泛參與AT1受體下游信號(hào)通路的調(diào)節(jié)?；诖耍疚膶⒕C述βArrs對(duì)AT1受體信號(hào)通路的調(diào)節(jié)及其意義。

Fig 1 β-arrestins mediated endocytosis of AT1receptor

1 βArrs對(duì)AT1受體的調(diào)節(jié)

1.1 AT1受體脫敏和內(nèi)化 AngⅡ刺激AT1受體后，βArrs向AT1受體轉(zhuǎn)位，阻遏 AT1受體與 Gq/11的偶聯(lián)，即阻斷Gq/11信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致受體快速脫敏。同時(shí)AT1受體的內(nèi)化降低了胞膜表面受體數(shù)量，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)一步脫敏。

βArrs介導(dǎo)的AT1受體內(nèi)化過(guò)程已研究得比較清楚［7］，即是指AT1受體-βArrs復(fù)合物經(jīng)衣被小泡(clathrin-coated vesicles)介導(dǎo)的內(nèi)吞(Fig 1)、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、定位分選以及降解過(guò)程。有幾類(lèi)蛋白參與了這一過(guò)程，包括G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GRKs)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(發(fā)動(dòng)蛋白dynamin、籠形蛋白clathrin和銜接蛋白AP2)、小G蛋白(Rab家族和ARF6)和泛素化蛋白。

1.2 βArr1和 βArr2 AT1受體與 βArr1和 βArr2具有相同的高親和力，但βArr1和βArr2對(duì)AT1受體的調(diào)節(jié)作用并不完全一致。例如，βArr1和βArr2均能參與AT1受體的內(nèi)化過(guò)程［8］，而AngⅡ誘導(dǎo)ERK1/2的激活是βArr2依賴的，與βArr1無(wú)關(guān)。這可能與AT1受體-βArrs復(fù)合物的穩(wěn)定性和βArrs部分結(jié)構(gòu)域的差異有關(guān)［9］。

Fig 2 β-arrestins and Gα protein dependent signaling pathways of AT1receptor

2 βArrs與AT1受體的信號(hào)通路

除了具有介導(dǎo)GPCRs的內(nèi)化、阻遏Gα蛋白與GPCRs偶聯(lián)的經(jīng)典功能，得益于自身的多個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，βArrs還可作為支架蛋白，與多種信號(hào)分子直接結(jié)合，開(kāi)啟不依賴Gα蛋白的信號(hào)通路［10］。AT1受體-βArrs復(fù)合物內(nèi)吞到胞質(zhì)后，βArrs可與各種蛋白結(jié)合，形成“信號(hào)體(signalsome)”(Fig 1)，參與下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)。

2.1 MAPK通路 MAPK家族廣泛參與AT1受體的介導(dǎo)的多種細(xì)胞反應(yīng)，如增殖、肥大等。MAPK家族包括ERK1/2、JNKs和p38MAPK，目前僅有證據(jù)表明βArrs參與AT1受體下游ERK1/2、JNKs兩條通路的調(diào)節(jié)(Fig 2)。

2.1.1 ERK1/2通路 ERK1/2是AT1受體下游信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中研究得最多的MARK家族成員。刺激AT1受體可經(jīng)過(guò)不同的途徑激活ERK1/2，包括已經(jīng)闡明的Gq/11依賴的PKC/Raf-1/ERK1/2 和 βArr2 依 賴 的 AT1受 體-βArrs/Raf-1/ERK1/2兩條通路，另外c-Src或(和)EGFR“轉(zhuǎn)激活”依賴的Ras/Raf-1/ERK1/2通路似乎在Gq/11依賴和βArr2依賴的兩條通路中起到銜接作用。

Lefkowitz等［11］最早發(fā)現(xiàn)，AngⅡ刺激HEK293細(xì)胞，內(nèi)吞的AT1受體-βArr2復(fù)合物可以募集Raf-1、MEK和ERK1/2，形成信號(hào)體并激活ERK1/2。Turner等［12］發(fā)現(xiàn)AngⅡ刺激內(nèi)化突變失活的AT1受體仍能激活ERK1/2，同時(shí)PKC抑制劑可部分(≈50%)阻斷AngⅡ誘導(dǎo)的野生型AT1受體下游ERK1/2的磷酸化水平。Wei等［3］發(fā)現(xiàn)SⅡ只能部分激活ERK1/2活性，AngⅡ刺激Gq/11偶聯(lián)突變失活的AT1受體同樣只能誘導(dǎo)部分ERK1/2活性(≈50%);同時(shí)PKC抑制劑也只能部分取消AngⅡ誘導(dǎo)的野生型AT1受體下游ERK1/2的活性(≈60%)?？梢?jiàn)，ERK1/2可由Gq/11依賴和βArr2依賴的兩條通路激活，但ERK1/2的激活在時(shí)間空間定位上卻不同，這預(yù)示著兩種不同的激活方式可能介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)相同刺激的不同反應(yīng)。研究證實(shí)［13］，Gq/11/PKC可迅速激活ERK1/2，同時(shí)較快失活(半衰期≈2 min)，激活的ERK1/2可以向核轉(zhuǎn)位，并激活核內(nèi)底物，如 Elk-1;而βArr2依賴ERK1/2活性在5～10 min時(shí)達(dá)到峰值，ERK1/2活性可持續(xù)長(zhǎng)達(dá)90 min，但激活的ERK1/2局限于信號(hào)體周?chē)瑳](méi)有核轉(zhuǎn)錄活性。目前，βArr1參與調(diào)控ERK1/2活性的作用的結(jié)論尚不統(tǒng)一［14］。

AT1受體下游的ERK1/2活性還可經(jīng)EGFR/Ras或c-Src/Ras途徑激活。AngⅡ刺激AT1受體后可轉(zhuǎn)激活EGFR，然后募集 Shc、Grb2和 Sos，進(jìn)而激活 Ras/ERK1/2級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而EGFR的轉(zhuǎn)激活過(guò)程又是 c-Src依賴的［1］。Shah等［15］和Turner等［12］分別發(fā)現(xiàn)，內(nèi)化突變失活的AT1受體或者受體內(nèi)吞受抑制后，AngⅡ仍能激活ERK1/2，而EGFR特異性抑制劑可以阻斷ERK1/2激活。有趣的是，Seta等［16］發(fā)現(xiàn)，－COOH端缺失的AT1受體阻斷了c-Src/Ras/ERK1/2通路;而Gq/11偶聯(lián)突變失活的AT1受體則保存AngⅡ誘導(dǎo)的c-Src激活，但c-Src/Ras激活的ERK1/2沒(méi)有核轉(zhuǎn)位活性。由此看來(lái)，EGFR/Ras/ERK1/2似乎是βArrs非依賴的途徑，而c-Src/Ras/ERK1/2則是 Gq/11非依賴的。事實(shí)上，Kim等［17］進(jìn)一步證實(shí)了βArrs非依賴和Gq/11非依賴的ERK1/2激活途徑最終都匯聚到了c-Src/EGFR通路上。

AT1受體下游的Gq/11依賴的ERK1/2和βArrs依賴的ERK1/2通路在原代培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞［17］和心肌細(xì)胞［18］以及離體心臟灌流模型［19］上均已得到證實(shí)。

2.1.2 JNKs通路 AngⅡ激活JNKs需要多種Gα 蛋白依賴的胞內(nèi)激酶參與，包括Rho家族的RhoA和Rac，Pyk-2和α-PAK［2］。βArrs作為支架蛋白可與 ASK1和JNK形成復(fù)合物，參與JNK的激活。McDonald等［20］發(fā)現(xiàn) AngⅡ刺激過(guò)表達(dá)βArr2的COS-1細(xì)胞導(dǎo)致JNK3激活，但激活的JNK3活性僅局限于胞質(zhì)，不能向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，免疫印跡檢測(cè)βArr2的共沉淀蛋白可檢出 ASK1，MKK4和 JNK3。與 βArrs依賴的ERK1/2激活一樣，AngⅡ誘導(dǎo)的JNK3激活的是βArr2依賴的，但其意義尚不明確。

2.2 酪氨酸激酶通路 Gβγ蛋白和活性氧簇可能參與AngⅡ誘導(dǎo)的c-Src激活，具體機(jī)制并不清楚［2］。EGFR可被包括AT1受體在內(nèi)的的多種GPCRs轉(zhuǎn)激活，AngⅡ誘導(dǎo)EGFR轉(zhuǎn)激活需要多個(gè)信號(hào)分子參與，如Ca2+、c-Src、HB-EGF和ADAM17 等［1］(Fig 2)。

Fessart等［21］發(fā)現(xiàn)，AngⅡ刺激血管平滑肌細(xì)胞可誘導(dǎo)βArr2、c-Src和AP2形成復(fù)合物，參與AT1受體內(nèi)化過(guò)程。研究［22］發(fā)現(xiàn)SⅡ的誘導(dǎo)的ERK1/2活性可被EGFR抑制劑完全阻斷，說(shuō)明βArrs可能參與SⅡ誘導(dǎo)EGFR的轉(zhuǎn)激活。Kim等［17］認(rèn)為，c-Src可被 βArr2募集并激活，進(jìn)而磷酸化EGFR特異位點(diǎn)，介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)的EGFR轉(zhuǎn)激活。βArrs參與AT1受體下游的酪氨酸激酶通路調(diào)節(jié)的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步明確。

2.3 Rho/ROCK通路 Rho/ROCK通路廣泛參與調(diào)節(jié)AT1受體介導(dǎo)細(xì)胞收縮、遷移與細(xì)胞骨架重構(gòu)，胞內(nèi)Rho的活性受三類(lèi)調(diào)節(jié)蛋白共同維持，分別是GTP酶激活蛋白、鳥(niǎo)苷酸交換因子和鳥(niǎo)苷酸解離抑制劑(GAPs、GEFs和GDIs)。AngⅡ可激活A(yù)T1受體下游G12/13依賴或Gq/11/PKC依賴的RhoGEFs，繼而激活 Rho/ROCK 通路［1］(Fig 2)。

最新研究表明，βArrs可能參與激活Rho/ROCK通路。AngⅡ刺激轉(zhuǎn)染了AT1受體的HEK293細(xì)胞后，RhoA迅速激活并在1min內(nèi)達(dá)到最大值，而siRNA干擾βArr1則明顯降低RhoA活性［23］。另有研究［24］證明 βArr2特異的 siRNA預(yù)處理轉(zhuǎn)染AT1受體的HEK293細(xì)胞，AngⅡ刺激產(chǎn)生胞膜起泡的細(xì)胞數(shù)量明顯降低，而這一現(xiàn)象由Rho/ROCK/MLCK通路介導(dǎo)。

2.4 其他信號(hào)通路 機(jī)械應(yīng)力刺激也能產(chǎn)生偏向性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Rakesh等［25］發(fā)現(xiàn)，機(jī)械應(yīng)力刺激后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的βArrs構(gòu)象變化與SⅡ刺激產(chǎn)生的相同，缺失βArrs或AT1受體的小鼠心臟對(duì)機(jī)械應(yīng)力刺激不產(chǎn)生βArrs依賴的信號(hào)，如EGFR轉(zhuǎn)激活、ERK1/2和Akt的激活。

3 βArrs與AT1受體介導(dǎo)的病理生理

3.1 細(xì)胞收縮 作為腎素－血管緊張素系統(tǒng)的主要活性物質(zhì)，AngⅡ首要作用就是收縮血管，且具有對(duì)心臟的正性肌力作用。AngⅡ刺激AT1受體，活化細(xì)胞內(nèi)鈣離子，激活PKC，繼而收縮細(xì)胞(心肌和血管平滑肌細(xì)胞)。

Rajagopal等［26］報(bào)道了βArr2可參與心肌細(xì)胞收縮的調(diào)節(jié)，他們證實(shí)了SⅡ與AngⅡ可增強(qiáng)離體培養(yǎng)心肌細(xì)胞的縮短分?jǐn)?shù);PKC抑制劑降低AngⅡ作用的70%，不改變SⅡ的作用;敲除βArr2則取消SⅡ的作用，不改變AngⅡ的作用。說(shuō)明βArr2可部分參與AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞正收縮性的調(diào)節(jié)。同樣的實(shí)驗(yàn)方法證明后來(lái)發(fā)現(xiàn)的AT1受體的βArrs偏向激動(dòng)劑 TRVs(TRV120027，120026，120023，AngⅡ 衍生多肽)［27］和曲格列酮［28］也具有正性肌力作用。但 Aplin 等［19］在離體心臟灌流模型上并未發(fā)現(xiàn)SⅡ的正性肌力作用。這可能與SⅡ的低親和力以及細(xì)胞與離體器官不同水平的實(shí)驗(yàn)差異有關(guān)。目前βArrs介導(dǎo)的AngⅡ?qū)π呐K的正性肌力作用具體機(jī)制仍不清楚。

我們?cè)陔x體血管張力實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，βArr1或βArr2敲除小鼠的離體胸主動(dòng)脈對(duì)AngⅡ或新福林誘導(dǎo)的血管收縮反應(yīng)與野生型小鼠相比無(wú)明顯差別(結(jié)果未發(fā)表)。而Hennenberg等［29］發(fā)現(xiàn)四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的胸主動(dòng)脈對(duì)AngⅡ的反應(yīng)性降低。說(shuō)明βArrs可能參與病理?xiàng)l件下AngⅡ?qū)ρ軓埩Φ恼{(diào)節(jié)。

3.2 增殖、肥大與凋亡抑制 AngⅡ在可誘導(dǎo)刺激平滑肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞(新生鼠)增殖與肥大［30］，其效應(yīng)主要由AT1受體下游的MARK通路介導(dǎo)。AngⅡ誘導(dǎo)的ERK1/2不同激活模式可能分別參與其肥大和增殖效應(yīng)。Aplin等［18］在原代培養(yǎng)的新生鼠心肌細(xì)胞上證實(shí)，SⅡ刺激DNA合成和細(xì)胞膜數(shù)量增加的能力與AngⅡ相同;但SⅡ不能刺激細(xì)胞肥大性增長(zhǎng);表現(xiàn)為SⅡ缺乏AngⅡ誘導(dǎo)的核內(nèi)Elk-1磷酸化以及誘導(dǎo) c-fos和 ANP轉(zhuǎn)錄的能力，但可調(diào)節(jié)胞質(zhì)底物p90RSK磷酸化。Kim等［17］進(jìn)一步證明，干擾βArr2表達(dá)可取消SⅡ和AngⅡ刺激平滑肌細(xì)胞合成DNA的能力?？梢?jiàn)，AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞的增殖效應(yīng)主要是βArr2依賴的ERK1/2激活介導(dǎo)的，ERK1/2磷酸化胞質(zhì)底物p90RSK可能與增殖效應(yīng)有關(guān)。最近Smith等［31］和Ohtsu等［32］分別報(bào)道了 AngⅡ刺激心肌細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞肥大的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，他們一致認(rèn)為依賴Gq/11轉(zhuǎn)激活 EGFR的途徑活化下游ERK1/2，是刺激細(xì)胞產(chǎn)生肥大效應(yīng)的主要途徑，βArrs不參與該過(guò)程。

βArrs可抑制多種 GPCRs誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［33］，βArr1/2全敲除比野生型的MEFs對(duì)GPCRs介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡數(shù)更多。Ahn等［34］證實(shí)AngⅡ或SⅡ預(yù)處理 VSMCs或 HEK293細(xì)胞可減少H2O2或依托泊苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，siRNA干擾βArr2則取消 AngⅡ的抗凋亡作用。此外，AngⅡ誘導(dǎo)的胞質(zhì)ERK1/2活性可磷酸化胞質(zhì)底物Mnk1，參與蛋白質(zhì)合成過(guò)程［35］，這一過(guò)程是 βArr2 依賴的。

3.3 體液調(diào)節(jié) AngⅡ可刺激醛固酮產(chǎn)生，參與水鹽平衡的調(diào)節(jié);AngⅡ還能直接刺激大腦中樞，調(diào)節(jié)鹽和水的攝取量。Lymperopoulos等［36］研究表明，βArr1參與AngⅡ刺激產(chǎn)生醛固酮過(guò)程，體外SⅡ刺激可上調(diào)醛固酮合成限速酶，產(chǎn)生并分泌醛固酮;體內(nèi)過(guò)表達(dá)βArr1增加循環(huán)醛固酮水平。Daniels等［37］通過(guò)第三腦室注射 SⅡ、AngⅡ、SⅡ +AngⅡ發(fā)現(xiàn)，SⅡ比AngⅡ刺激攝取更多NaCl，SⅡ不增加反而拮抗AngⅡ?qū)λ臄z取。可見(jiàn)，AngⅡ?qū)Υ笫蟮乃}平衡調(diào)節(jié)上也存在Gq/11和βArrs依賴的兩條途徑。

3.4 其他 βArrs還參與了的AngⅡ其他作用，如AngⅡ介導(dǎo)的趨化性［38］、應(yīng)力纖維的形成［23］以及質(zhì)膜起泡［24］等過(guò)程。

4 展望

AngⅡ誘導(dǎo)的AT1受體下游的復(fù)雜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是AngⅡ多樣化的病理生理作用的基礎(chǔ)，βArrs的參與使得AT1受體下游的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)分為Gq/11依賴和βArrs依賴的兩條不同的通路。兩條信號(hào)通路獨(dú)立介導(dǎo)或協(xié)同參與AngⅡ誘導(dǎo)的不同細(xì)胞反應(yīng)，進(jìn)一步闡明了AngⅡ多種生理病理效應(yīng)的分子機(jī)制。但是，細(xì)胞水平的信號(hào)通路研究還需要整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持，利用基因敲除小鼠和偏向激動(dòng)劑作為研究手段，將進(jìn)一步確認(rèn)βArrs在AngⅡ調(diào)節(jié)心血管活動(dòng)中的意義。

偏向激動(dòng)劑的出現(xiàn)不僅作為一種研究手段促進(jìn)了βArrs的功能研究，也為新藥研發(fā)開(kāi)辟了思路。臨床廣泛使用的降壓藥血管緊張受體阻斷劑可拮抗AngⅡ的縮血管作用，從而降低血壓。但這種拮抗作用可能同時(shí)阻斷了AngⅡ的其他有利效應(yīng)，如抗凋亡等細(xì)胞保護(hù)以及心肌的正性肌力作用。偏向激動(dòng)劑的優(yōu)勢(shì)在于不僅可以阻斷AT1受體下游Gq/11依賴性信號(hào)通路的不利作用，還激活A(yù)T1受體的βArrs依賴的有益信號(hào)通路，推測(cè)對(duì)充血性心衰、缺血/再灌注心肌損傷可能有更好的治療作用。最新研究報(bào)道，TRV120027作為一種新型的偏向激動(dòng)劑，正在開(kāi)展二期臨床實(shí)驗(yàn)，用于治療心衰患者。當(dāng)然，并不是所有βArrs依賴的作用都是有益的，例如βArr1介導(dǎo)了AngⅡ刺激醛固酮分泌這一過(guò)程［36］。因此，更深入的研究對(duì)于進(jìn)一步闡明βArrs參與AngⅡ?qū)π难芑顒?dòng)的調(diào)節(jié)作用是非常有必要的。

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