胰蛋白酶制備乳蛋白水解物的研究

付 莉，岳喜慶 ，趙 凱

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110161;2.遼寧醫(yī)學(xué)院食品學(xué)院，遼寧錦州121001)

嬰兒是處于特殊生長發(fā)育階段的、具有特殊營養(yǎng)需求的一類群體。母乳是適合嬰兒生長發(fā)育的最完美的食物。但是，有的母親因?yàn)閭€(gè)人、文化、社會(huì)經(jīng)濟(jì)和健康等原因選擇人工哺乳。當(dāng)母乳缺乏時(shí)，牛乳因其來源廣泛、與母乳成分較為接近而常被用來作為母乳的替代品。而牛乳與人乳蛋白質(zhì)含量與成分的差異是嬰兒對牛乳不適癥的主要原因［1－2］。大量的流行病學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)牛乳蛋白過敏是新生兒和嬰兒中最普遍的一類過敏。而牛乳中的αs－酪蛋白、β－乳球蛋白是主要的致敏蛋白源。很多研究表明，酶解、糖基化、發(fā)酵等方法都能夠降低牛乳中的過敏原。而利用酶解法水解，由于水解位點(diǎn)特異性強(qiáng)，利于工業(yè)化生產(chǎn)，而廣泛用于乳制品生產(chǎn)中。目前利用胰蛋白酶水解全脂牛乳的研究較少，為提高全脂牛乳的水解率，本實(shí)驗(yàn)以全脂牛乳的水解過程為對象，對水解工藝條件進(jìn)行優(yōu)選。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對牛乳水解的工藝進(jìn)行全面的研究，為嬰兒配方乳的研發(fā)提供一定的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

全脂鮮牛奶 錦州市售;胰蛋白酶(18380.23U/g)、風(fēng)味蛋白酶(15285.71U/g)、胃蛋白酶(6230U/g)、堿性蛋白酶(18761.90U/g)、中性蛋白酶(13847.19U/g)、木瓜蛋白酶(15285.71U/g) 購于天津諾奧科技酶制劑公司;低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(97400～14400u) 購于上海生物化學(xué)研究所;茚三酮、果糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、無水乙醇 均為分析純;αs－酪蛋白、β－乳球蛋白、羊抗兔IgG－HRP 購于sigma公司;抗體為兔抗β－LG血清、兔抗αs－酪蛋白血清 自制。

恒溫水浴振蕩器、紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;DYY－6C電泳儀 北京六一儀器廠;DYCZ－24B電泳槽 北京六一儀器廠;96孔酶標(biāo)板(聚苯乙烯)Costar;酶標(biāo)儀 Thermo Multiskan MK3。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牛乳蛋白水解工藝［3］稱取鮮牛乳，預(yù)熱10min，加入一定量的蛋白酶，恒溫振蕩一定時(shí)間，取出，放入90℃水浴滅酶10min，冷卻，取原乳和原乳水解液稀釋，利用茚三酮比色法測定牛乳蛋白的水解度。

1.2.2 牛乳蛋白水解度的計(jì)算 計(jì)算式如下:

式中:DH:水解度(%);h:水解后每克蛋白被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)(mmol);htot:每克原料蛋白質(zhì)的肽鍵毫摩爾數(shù)(mmol);N×F:全脂乳蛋白質(zhì)含量(g/L);［－NH2］水解液:水解液的－NH2的含量(mmol/L);［－NH2］原料:原料乳的－NH2的含量(mmol/L);8.3:mmoL/g。

1.2.3 水解用酶的篩選 牛乳中分別加入0.1%的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶，分別于 37、55、55、50、50、37℃水解30min，綜合水解度、苦味程度、色澤、狀態(tài)、pH，篩選出水解效果較好的蛋白酶。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化牛乳蛋白水解工藝 通過單因素實(shí)驗(yàn)對酶解溫度、酶濃度、酶解時(shí)間進(jìn)行研究，結(jié)果顯示最佳酶解溫度為55℃，最佳酶濃度為0.7%，最佳酶解時(shí)間為40min，因此在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)之上，應(yīng)用Centure－Composite Design中心組合進(jìn)行三因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以牛乳蛋白水解度為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)因子及水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.5 SDS－PAGE電泳分析 用5%濃縮膠和15%分離膠，濃縮膠在80V電壓下運(yùn)行1h，分離膠在120V電壓下運(yùn)行3h。以低分子量marker標(biāo)準(zhǔn)為參比，得到所需蛋白條帶分子。上樣量均為15μL。

1.2.6 樣品αs－酪蛋白和β－乳球蛋白抗原性的測定［4］采用間接競爭ELISA方法測定樣品中β－乳球蛋白和αs－酪蛋白的殘余抗原性。β－乳球蛋白和αs－酪蛋白分別經(jīng)包被、洗滌、封閉制備包被抗原，分別加入樣品(原乳或水解液)和稀釋后的β－LG或兔αs－酪蛋白血清，培養(yǎng)、洗滌，加入稀釋后的羊抗兔IgG－HRP培養(yǎng)，洗滌、顯色、終止反應(yīng)、比色。樣品和包被抗原競爭與抗體結(jié)合，因此包被抗原與抗體生成復(fù)合物的量與被測物中抗原量成反比。水解后牛乳的抗原性變化可用抗原降低率表示。

抗原降低率(%)=(A水解液－A原乳)/(A無競爭－A原乳)×100，其中A為被測物用酶聯(lián)免疫檢測儀在特征波長492nm和非特征波長630nm測得的吸收值之差;A水解液、A原乳、A無競爭分別指間加入競爭抗原分別為水解液、原乳和不加抗原的無競爭反應(yīng)體系的A值。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同蛋白酶對牛乳蛋白水解度的影響

不同蛋白酶對牛乳蛋白水解度的影響如表2所示。由表2可以看出綜合水解度、苦味程度，色澤、狀態(tài)、pH變化考慮，同等條件下采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶水解牛乳蛋白效果較好。但是牛乳經(jīng)木瓜蛋白酶水解后分層嚴(yán)重且苦味較重，不適合后期配制嬰兒配方乳，而牛乳經(jīng)胰蛋白酶水解后，水解度最高，且苦味較小，因此本實(shí)驗(yàn)選定胰蛋白酶為水解用酶進(jìn)行后續(xù)研究。

表2 不同蛋白酶對牛乳蛋白水解度的影響Table 2 Effect of different proteases on milk protein hydrolysis degree

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化牛乳蛋白水解的條件［5－6］

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用 Centure－Composite Design中心組合進(jìn)行三因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Response surface experimental design and results of the test

如表3所示，Centure－Composite Design中心實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了20個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，14點(diǎn)為析因?qū)嶒?yàn)點(diǎn)，6點(diǎn)為中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，用來估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。同時(shí)通過擬合得到響應(yīng)面的二次方程為:Y=20.15+0.017A+0.88B+0.69C－0.24AB+0.044AC+0.094BC－1.17A2－0.54B2－0.55C2(R2=0.9252)?；貧w分析對方程和方程的各個(gè)因子進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。

表4 回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析Table 4 Regression model test and analysis of variance

表4顯示該模型的p=0.0002，說明模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，自變量和響應(yīng)值之間關(guān)系顯著，實(shí)驗(yàn)誤差小，因此，可用該回歸模型代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。

為直觀尋找最適宜變量組合，使得響應(yīng)值達(dá)到最大，采用Design Expert軟件對3因素之間的交互作用進(jìn)行全面的模型分析，并繪制響應(yīng)面曲線圖。響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各實(shí)驗(yàn)因子A、B、C所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上可形象地看出最佳參數(shù)及各級參數(shù)之間的相互作用。當(dāng)特征值均為正值時(shí)，響應(yīng)面的分析圖為山谷形曲面，有極小值存在;當(dāng)特征值為負(fù)值時(shí)，響應(yīng)面的分析圖形為山丘形曲面，有極大值存在;當(dāng)特征值有正有負(fù)時(shí)，為馬鞍形曲面，無極值存在。等高線圖可以直觀地反映兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反。圖1中響應(yīng)面圖均非橢圓形，表明各圖中兩因素交互作用不顯著［7］。

由圖1(A)可見，隨著溫度的增加，牛乳蛋白的水解度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。溫度恒定時(shí)，隨著酶濃度的增加，牛乳蛋白水解度先顯著增加而后增加趨于平緩。在溫度為52～58℃，酶濃度為0.7%～0.8%，牛乳蛋白質(zhì)水解度最大值在20%以上。因?yàn)榧用噶康侥骋恢禃r(shí)，酶與底物達(dá)到飽和，過多的酶會(huì)使酶自身發(fā)生分解，過高或過低的溫度都使酶的活性降低，因此溫度和酶濃度適宜時(shí)，牛乳蛋白的水解度才能達(dá)到最高［8］。

由圖1(B)可見，隨著時(shí)間的增加，牛乳蛋白的水解度都呈現(xiàn)增加后減少的趨勢。當(dāng)時(shí)間恒定時(shí)，隨著酶濃度的增加，牛乳蛋白水解度開始增加顯著而后增加趨于平緩。在溫度為53～57℃，時(shí)間為38～50min，牛乳蛋白質(zhì)水解度最大值在20%以上。因?yàn)檫^長時(shí)間的水解會(huì)使酶自身發(fā)生分解，過高或過低的溫度都使酶的活性降低，因此溫度和酶解時(shí)間適宜時(shí)，牛乳蛋白的水解度才能達(dá)到最高［9］。

由圖1(C)可見，隨著時(shí)間增加，牛乳蛋白的水解度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當(dāng)時(shí)間恒定時(shí)，隨著酶濃度的增加，牛乳蛋白水解度開始增加顯著而后增加趨于平緩。在時(shí)間為36～50min，酶濃度為0.68%～0.8%，牛乳蛋白質(zhì)水解度最大值在20%以上。因?yàn)榧用噶康侥骋恢禃r(shí)，酶與底物達(dá)到飽和，過多的酶和過長時(shí)間的酶解會(huì)使酶自身發(fā)生分解，因此酶解時(shí)間和酶濃度適宜時(shí)，牛乳蛋白的水解度才能達(dá)到最高［10-11］。

圖1 響應(yīng)曲面圖Fig.1 Response surface plot

根據(jù)Centure－Composite Design實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，利用Design Expert軟件獲得了水解度最高時(shí)的各個(gè)因素的最佳水解條件為:溫度55℃、酶濃度0.8%、水解時(shí)間47min，在此水解條件下，水解度為20.78%。

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在以上得出的最佳水解條件下進(jìn)行水解，做3組平行實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果分別為21%、20.45%和20.76%，與理論最大值接近，可見該模型能較好地預(yù)測實(shí)際水解情況。

2.3 水解過程中αs－酪蛋白和β－乳球蛋白抗原降低率的變化

從圖2可以看出，隨著水解時(shí)間的增加，水解度不斷增加，而αs－酪蛋白的抗原降低率先增加后減少而后又增加?？梢姦羢－酪蛋白的水解度與抗原降低率變化沒有明顯的規(guī)律。主要原因是αs－酪蛋白有過敏表位，隨著水解的進(jìn)行，有的過敏表位被水解掉，但同時(shí)又有些隱藏在內(nèi)部的過敏表位暴露出來，反而增強(qiáng)了其抗原性。當(dāng)水解時(shí)間為50min時(shí)，抗原殘留率為82%，αs－酪蛋的抗原性大大降低。

圖2 αs－酪蛋白水解度與抗原降低率關(guān)系圖Fig.2 Relationship of hydrolysis degree of milk protein and antigen reduction rate of αs－casein

從圖3可以看出，隨著水解時(shí)間的增加，水解度不斷增加，而β－乳球蛋白的抗原降低率逐漸增加。當(dāng)水解時(shí)間為50min左右時(shí)，抗原降低率為51%，變化趨于穩(wěn)定。在水解過程中，酪蛋白對胰蛋白酶敏感，大部分被水解掉，其抗原性降低十分顯著。而β－乳球蛋白對蛋白酶的抵抗能力較強(qiáng)，抗原性下降相對較低。胰蛋白酶是外肽酶，特異性水解疏水鏈N端。外肽酶不能水解分子內(nèi)肽鍵，分子內(nèi)大量的過敏位點(diǎn)得以保存，從而不能有效降低β－乳球蛋白的抗原性。

圖3 β－乳球蛋白水解度與抗原降低率關(guān)系圖Fig.3 Relationship of hydrolysis degree of milk protein and antigen reduction rate of β－lactoglobulin

2.4 牛乳蛋白水解液的SDS－PAGE電泳結(jié)果

從圖4可以看出，αs－酪蛋白被水解掉約90%以上，這樣在很大程度消除了難于消化的αs－酪蛋白，從而對提高消化率有利;而且，乳清蛋白中的β－乳球蛋白也有一定的降解作用，降低了β－乳球蛋白的含量，從而降低了致敏蛋白的比例，而且有相當(dāng)數(shù)量的功能性肽產(chǎn)生。

圖4 全脂牛乳與全脂牛乳水解液的SDS－PAGE圖Fig.4 SDS－PAGE of full fat milk and its hydrolyzate

3 結(jié)論與討論

3.1 建立了以牛乳蛋白水解度為響應(yīng)值，以加酶量、時(shí)間、溫度為三因素的數(shù)學(xué)模型。在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，影響牛乳蛋白質(zhì)水解度的主次順序?yàn)榧用噶?、時(shí)間、溫度。方差分析表明該模型擬合得較好。最終確定出牛乳蛋白水解的最適宜酶解工藝條件為:酶濃度0.8%、時(shí)間47min、溫度55℃。在最適宜條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到蛋白質(zhì)水解度平均值為20.74%，與理論值20.78%相差不明顯，說明該模型可以較好地反映牛乳蛋白質(zhì)水解的條件。

3.2 通過測定牛乳在10～60min水解過程中，乳蛋白水解度與抗原降低率的數(shù)值，發(fā)現(xiàn)牛乳在水解50min時(shí)，其中αs－酪蛋白被大部分水解掉，其抗原性大大降低。β－乳球蛋白的抗原性也有一定程度的減少，抗原性也有所降低。

3.3 在最適條件下水解得到的牛乳蛋白水解液，其中αs－酪蛋白和β－乳球蛋白抗原性均有不同程度的減少，有效地減少了乳蛋白的過敏性。但是水解液的苦味較重，后期配制嬰兒配方乳時(shí)，可采用物理方法脫除水解液的苦味，如在蛋白質(zhì)水解液中加入多聚磷酸鹽、明膠、交聯(lián)淀粉、濃縮乳清蛋白、脫脂奶及大豆、?；撬?、環(huán)狀糊精等來掩蓋苦味。

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