亞甲基藍(lán)對(duì)腸出血性大腸桿菌O157的光動(dòng)力殺菌技術(shù)研究

唐姝姝，唐書(shū)澤，* ，李紅愛(ài)，范方輝，吳希陽(yáng)，陳振強(qiáng)

(1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州510632;2.暨南大學(xué)光電工程系，廣東廣州510632)

腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157是上世紀(jì)末新發(fā)現(xiàn)的危害嚴(yán)重的新型人類(lèi)致病菌，能夠致人腹瀉、出血性結(jié)腸炎(HC)，還可在5%～10%的病例中引發(fā)溶血性尿毒綜合征(HUS)及血栓性血小板減少紫癜(TTP)等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重者可致死亡［1］。該菌對(duì)加熱的抵抗力比其他腸道菌要強(qiáng)，少數(shù)巴氏殺菌也不能將其完全殺滅，在水中可存活數(shù)月，在冷藏條件下比在室溫條件下能存活更久［2］。近20年來(lái)，EHEC O157∶H7引發(fā)的食物中毒在世界各地都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行，已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，對(duì)人們的健康構(gòu)成了巨大威脅［1］。光動(dòng)力療法(Photodynamic therapy，PDT)是目前國(guó)際上正在發(fā)展的一種新技術(shù)，它主要利用光激活光敏劑產(chǎn)生光化學(xué)效應(yīng)選擇性的殺傷病原微生物，目前已經(jīng)成功應(yīng)用于惡性腫瘤的治療等方面。光動(dòng)力滅菌技術(shù)(APDT)基于光動(dòng)力作用，是指利用光敏劑能夠選擇性富集在目標(biāo)細(xì)胞或組織(如各種病源微生物)，并在特定波長(zhǎng)的可見(jiàn)光照射情況下生成大量活性氧，進(jìn)而通過(guò)活性氧與多種生物大分子的相互作用，損傷目標(biāo)細(xì)胞組織從而影響其正常生理功能，但不傷害周?chē)?xì)胞和組織的特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)微生物有效殺滅的一項(xiàng)新技術(shù)［2－4］。亞甲基藍(lán)(Methylene blue，MB)是一種常見(jiàn)的堿性染料，由于其滲透系數(shù)高于其他染料，易穿透細(xì)胞膜在細(xì)菌體內(nèi)部集中，從而在細(xì)菌的細(xì)胞膜上染色，于特定波長(zhǎng)的光結(jié)合產(chǎn)生光動(dòng)力學(xué)效應(yīng)。在對(duì)細(xì)菌進(jìn)行光動(dòng)力作用前需要將其置于光敏劑中避光孵育，這段時(shí)間可以使光敏劑停留在菌體內(nèi)并聚集，提高光動(dòng)力作用的殺菌效果［5］。國(guó)外從90年代起已開(kāi)展了基于MB的光滅活血漿中病毒的研究工作，但在微生物方面的應(yīng)用才剛剛起步［6－7］。MB－APDT 對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有很強(qiáng)的殺傷作用，而其在革蘭氏陰性菌中的研究卻鮮有報(bào)道。革蘭氏陰性菌由于具有復(fù)雜的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，屏蔽了細(xì)胞膜與單重態(tài)氧的有效結(jié)合，降低了光動(dòng)力療法的殺傷作用，使得其比陽(yáng)性菌更難殺滅［8－9］。本實(shí)驗(yàn)選擇腸出血性大腸桿菌O157作為實(shí)驗(yàn)菌株，通過(guò)對(duì)各種殺菌條件的探索，提高M(jìn)B－APDT處理對(duì)O157的滅活效果，尋求該技術(shù)對(duì)革蘭氏陰性菌的最佳作用條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157菌株 由廣州市疾病預(yù)防控制中心饋贈(zèng);細(xì)菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基 均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;亞甲基藍(lán)(10g/L) 購(gòu)自上海紅綠光敏劑研究所有限公司。

U21901雙光束紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;75W溴鎢燈(光功密度200mW/cm2) 北京卓立漢光儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌接種及培養(yǎng) 將活化的大腸桿菌的菌懸液以1∶100的比例接種于100mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體(4000r/min，10min)，棄去上清液，使菌體重新懸浮于0.1mol/mL的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，并使其OD600=0.5(相當(dāng)于107CFU/mL左右)。

1.2.2 單因素影響實(shí)驗(yàn) 以O(shè)157菌落數(shù)為指標(biāo)，分別以MB濃度、光照時(shí)間、孵育時(shí)間為因素，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.1 光敏劑濃度實(shí)驗(yàn)［10］用PBS稀釋MB，加入菌液，配制 MB 終濃度分別為 0、1、5、10、25、50、75mg/L的菌懸液，備用。

將不同濃度 MB的菌懸液于37℃避光孵育10min后進(jìn)行光照，即在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板任取一孔，加入200μL菌懸液，37℃避光孵育10min，放在距離溴鎢燈光源20cm處光照10min。同時(shí)設(shè)置不加光敏劑、不孵育且不光照的空白對(duì)照組。

1.2.2.2 光照時(shí)間實(shí)驗(yàn) 將MB濃度為10mg/L的菌懸液于37℃避光孵育10min后進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)的光照，放在距離溴鎢燈光源20cm處光照0、5、10、20、30、45、60min。同時(shí)設(shè)置不加光敏劑、不孵育且不光照的空白對(duì)照組。

1.2.2.3 孵育時(shí)間實(shí)驗(yàn) 將MB濃度為10mg/L的菌懸液于 37℃ 分別避光孵育 0、1、5、10、15、20、30min后進(jìn)行光照。同時(shí)設(shè)置不加光敏劑、不孵育且不光照的空白對(duì)照組。

1.2.3 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Box－Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，選擇3因素3水平的響應(yīng)面分析方法，以MB濃度、光照時(shí)間、孵育時(shí)間為主要考察因素，各因素水平及編碼如表1所示。

1.2.4 細(xì)菌平板菌落計(jì)數(shù) 將1.2.2處理所得的菌懸液均以1∶10梯度稀釋后，每個(gè)梯度各取100μL于細(xì)菌平板菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基平皿中，37℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24h后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。為了使圖表更清晰，菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果以對(duì)數(shù)logCFU(mL)表示，并繪制相應(yīng)的折線圖。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The design of response surface methodology

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性差異用t檢驗(yàn)，p＜0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 MB－APDT對(duì)腸出血性大腸桿菌O157殺傷作用的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 MB濃度對(duì)腸出血性大腸桿菌O157菌落數(shù)的影響 不同濃度MB下腸出血性大腸桿菌O157的菌落數(shù)見(jiàn)圖1。當(dāng)MB濃度為1mg/L和5mg/L時(shí)，MB－APDT雖對(duì)細(xì)菌有一定的殺傷作用，但是殺傷效果不理想。MB濃度為10mg/L以上，O157的菌落數(shù)減少了3個(gè)對(duì)數(shù)以上，即能使99.9%以上的O157失活。可見(jiàn)，光照條件下，在MB的一定濃度范圍內(nèi)，O157的菌落數(shù)隨著MB濃度的增大而減少。而當(dāng)MB濃度增加到一定程度，會(huì)在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)外形成動(dòng)態(tài)平衡，阻礙MB進(jìn)一步進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，反而降低了光動(dòng)力的殺傷效果［11］。

圖1 MB濃度對(duì)腸出血性大腸桿菌O157菌落數(shù)的影響Fig.1 Effect of MB concentrations on LogCFU of EHEC O157

2.1.2 光照時(shí)間對(duì)腸出血性大腸桿菌O157菌落數(shù)的影響 不同光照時(shí)間下腸出血性大腸桿菌O157的菌落數(shù)見(jiàn)圖2。在其他條件相同的情況下，光照時(shí)間不同，MB－APDT的殺菌效果也不同。光照時(shí)間由5min增加至60min，菌落數(shù)呈現(xiàn)先顯著減少后略有增加的趨勢(shì);在光照時(shí)間為30min時(shí)，O157的菌落數(shù)最少約為1.45個(gè)對(duì)數(shù)。

2.1.3 孵育時(shí)間對(duì)腸出血性大腸桿菌O157菌落數(shù)的影響 不同孵育時(shí)間下腸出血性大腸桿菌O157的菌落數(shù)見(jiàn)圖3?？梢?jiàn)，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，開(kāi)始時(shí)菌落數(shù)逐漸減少，至15min時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)2個(gè)對(duì)數(shù)，再繼續(xù)延長(zhǎng)孵育時(shí)間超過(guò)15min，菌落數(shù)開(kāi)始略上升。

表3 回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 3 Reliability equation and significance test of the model

圖2 光照時(shí)間對(duì)腸出血性大腸桿菌O157菌落數(shù)的影響Fig.2 Effect of illumination time on LogCFU of EHEC O157

在相同的MB濃度及光照時(shí)長(zhǎng)下，孵育時(shí)間過(guò)短，MB與細(xì)菌細(xì)胞結(jié)合不完全，未能在菌體內(nèi)集中，不利于光動(dòng)力作用;但繼續(xù)延長(zhǎng)孵育時(shí)間至15min以上時(shí)，菌落數(shù)不會(huì)繼續(xù)下降反而略有上升，這是由于MB與細(xì)菌細(xì)胞結(jié)合完全后，MB已在菌體內(nèi)達(dá)到飽和，繼續(xù)延長(zhǎng)孵育時(shí)間反而不利于MB進(jìn)入，從而降低了 MB－APDT 的殺傷效果［12］。

圖3 孵育時(shí)間對(duì)腸出血性大腸桿菌O157菌落數(shù)的影響Fig.3 Effect of incubation time on the LogCFU of EHEC O157

2.2 響應(yīng)面分析MB－APDT優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn) 按照Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，根據(jù)實(shí)驗(yàn)因素和水平的要求，設(shè)計(jì)17次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 The experiment design and result of Box－Behnken response surface

應(yīng)用Design Expert 7.0軟件，對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，可得O157菌落數(shù)(Y)與MB濃度(A)、光照時(shí)間(B)、孵育時(shí)間(C)之間的多項(xiàng)二次回歸方程為:Y=1.34－0.056A－(1.000E－002)B－0.081C－0.065AB+0.028AC－0.025BC+0.071A2+0.13B2+0.061C2。

該模型的方差分析和顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表3。該模型p=0.0155＜0.05，表明二次多元回歸模型回歸效果顯著，不同處理間的差異顯著，失擬項(xiàng)p=0.0349＜0.05顯著;該模型的決定系數(shù)為0.9833，表明98.33%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可變性可用此模型解釋?zhuān)瑑H有總變異的1.67%不能用此模型來(lái)解釋;回歸模型的擬合度好，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值高度相關(guān)。

二次多項(xiàng)式的回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)表明，因素A和因素B對(duì)響應(yīng)值的線性效應(yīng)顯著，因素C對(duì)響應(yīng)值的線性效應(yīng)極顯著;因素AB對(duì)響應(yīng)值的交互影響顯著，AC和BC對(duì)響應(yīng)值的交互影響不顯著;說(shuō)明3個(gè)因素均不同程度的對(duì)響應(yīng)值產(chǎn)生了極顯著或顯著的影響。

2.2.2 O157菌落數(shù)響應(yīng)曲面分析 三因素交互作用的響應(yīng)面曲面圖見(jiàn)圖4～圖6。由此可分析評(píng)價(jià)任何兩因素對(duì)0157菌落數(shù)的交互影響，以確定最佳的因素水平范圍。

圖4 MB濃度與光照時(shí)間交互作用影響Fig.4 Effect of MB concentration and illumination time on the CFU of EHEC O157

圖5 MB濃度與孵育時(shí)間交互作用影響Fig.5 Effect of MB concentration and incubation time on the CFU of EHEC O157

圖6 MB濃度與孵育時(shí)間交互作用影響Fig.6 Effect of MB concentration and incubation time on the CFU of EHEC O157

由圖4知，MB濃度和光照時(shí)間相互作用對(duì)0157菌落數(shù)有顯著影響。當(dāng)光照時(shí)長(zhǎng)小于27.5min，隨著MB濃度的增加，O157菌落數(shù)呈現(xiàn)先下降后略微上升的趨勢(shì);當(dāng)光照時(shí)間較長(zhǎng)，隨著MB濃度的增加O157菌落數(shù)會(huì)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。在MB濃度不變的條件下，隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，0157菌落數(shù)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。

圖5顯示，MB濃度和孵育時(shí)間對(duì)O157菌落數(shù)無(wú)顯著影響。MB濃度不變時(shí)，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，O157菌落數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，且當(dāng)孵育時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，O157菌落數(shù)隨MB濃度變化不大;孵育時(shí)間不變時(shí)，隨著MB濃度的增加，O157菌落數(shù)也呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。

由圖6知，光照時(shí)間和孵育時(shí)間對(duì)O157菌落數(shù)的影響不顯著。孵育時(shí)間不變時(shí)，隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，O157菌落數(shù)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì);在光照時(shí)間不變的條件下，對(duì)著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，O157菌落數(shù)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。

由Design Expert 7.0軟件得到的優(yōu)化條件的處理，確定最佳的反應(yīng)條件為:MB濃度24.08mg/L、光照時(shí)間27.66min，孵育時(shí)間19.00min，預(yù)測(cè)值為1.00。在相應(yīng)的條件下，實(shí)驗(yàn)測(cè)得值為1.03，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為3%，與預(yù)測(cè)值接近，達(dá)到了優(yōu)化條件的目的。

3 結(jié)論

MB濃度，光照時(shí)間及孵育時(shí)間在光動(dòng)力滅菌技術(shù)中對(duì)O157菌落數(shù)都有顯著影響。應(yīng)用APDT殺滅腸出血性大腸桿菌O157的最佳反應(yīng)條件參數(shù)為:MB濃度 24.08mg/L、光照時(shí)間 27.66min，孵育時(shí)間19.00min，O157菌落數(shù)理論值為1.00，實(shí)驗(yàn)值為1.03。

本課題組前期的研究工作已經(jīng)證實(shí)光動(dòng)力殺菌技術(shù)對(duì)曲霉孢子［13］、革蘭氏陰性菌金黃色葡萄球菌［14］及單核細(xì)胞增多性李斯特菌［15］具有良好的滅菌效果，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化了應(yīng)用MB－APDT殺滅革蘭氏陰性菌腸出血性大腸桿菌O157的反應(yīng)條件。根據(jù)以往的相關(guān)滅菌技術(shù)，能使細(xì)菌菌落總數(shù)減少2～3個(gè)數(shù)量級(jí)以上的滅菌技術(shù)，即可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)母纳坪髴?yīng)用于食品工業(yè)的微生物控制中［16］。因此，光動(dòng)力殺菌技術(shù)也有可能被開(kāi)發(fā)成一種非常有效的殺滅革蘭氏陰性菌的技術(shù)應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域。

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