殼聚糖對Nisin抑菌穩(wěn)定性的影響研究

曾清清，張立彥，劉啟蓮

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510640)

乳鏈菌肽(Nisin)，是由屬于N型血清的某些乳酸鏈球菌(lactococcuslactis)在代謝過程中合成和分泌的具有很強殺菌作用的小肽，由34個氨基酸殘基組成［1］。目前，Nisin主要是作為食品防腐劑和抑菌劑在食品工業(yè)和醫(yī)藥業(yè)得到廣泛應(yīng)用［2－3］。溫度和pH會顯著影響Nisin的活性［4］，在儲放過程中Nisin也在不斷失活，Nisin的這些特性都將限制其應(yīng)用。因此有必要研究改善Nisin抑菌活性的措施或保護物質(zhì)，從而提高其抑菌穩(wěn)定性，延長其抑菌期限。殼聚糖(chitosan)是甲殼素經(jīng)脫乙酰處理得到的生物大分子，可用于保護蛋白質(zhì)等的生物活性，但尚未見有關(guān)于殼聚糖保護Nisin活性的報道。為此，本實驗研究了不同溫度和pH下殼聚糖對Nisin的保護效果，并結(jié)合紅外光譜和DSC的測定，進一步探討了其對Nisin活性的影響機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藤黃微球菌(Micrococcus luteus) CICC10209，廣州環(huán)凱微生物科技有限公司;Nisin 食品級，浙江銀象生物工程有限公司;殼聚糖 分析純，天津市華苑產(chǎn)業(yè)區(qū)鑫茂科技園。

Model 752型紫外可見分光光度計 上?，F(xiàn)科分光儀器有限公司;LDZX－30FA型手提式不銹鋼蒸汽消毒器 江陰頂江機械設(shè)備有限公司;DF－101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限公司;BSD－150型水浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;Nicolet 560型紅外光譜分析儀 Nicolet Company;Q200型差式掃描量熱儀TA Company。

1.2 實驗方法

1.2.1 Nisin 效價的測定［5］

1.2.1.1 培養(yǎng)基的配制 斜面培養(yǎng)基:蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，氯化鈉 5g/L，瓊脂 20g/L，pH7.0;種子培養(yǎng)基:蛋白胨 5g/L，牛肉膏 3g/L，氯化鈉 5g/L，pH7.0;CM檢測培養(yǎng)基:Tween20與水(體積比1∶1)混合物2g/L，胰蛋白胨8g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉5g/L，酵母抽提物5g/L，磷酸氫二鈉2g/L，pH6.8。

1.2.1.2 培養(yǎng)方法 種子培養(yǎng):藤黃微球菌菌種活化后接至斜面培養(yǎng)基，33℃培養(yǎng)1～2d，至斜面長好，將長好的斜面用無菌竹簽刮至100mL種子培養(yǎng)基中，33℃，150r/min搖床培養(yǎng)6h;檢測培養(yǎng):將培養(yǎng)好的種子液以10%(體積分數(shù))的接種量接至50mL CM檢測培養(yǎng)基中，加入適量經(jīng)熱處理的Nisin溶液，33℃，150r/min搖床培養(yǎng)5h，測定Nisin效價，每個實驗做3個平行樣，取平均值。

1.2.1.3 Nisin效價的測定 分光光度法［5］。

1.2.1.4 效價損失率的計算:

式中:C1:未經(jīng)處理時Nisin的效價;C2:經(jīng)過處理后Nisin的效價。

1.2.2 處理方法

1.2.2.1 溶液的配制 Nisin標準溶液:準確稱取10mg Nisin標準品(103IU/mg)，溶于10mL 0.02mol/L HCl中，配制成103IU/mL Nisin標準溶液備用;殼聚糖溶液:準確稱取1.0g殼聚糖，加1%的冰乙酸溶液溶解定容至100mL，配制成10g/L的殼聚糖溶液。

1.2.2.2 殼聚糖存在情況下pH及溫度對Nisin抑菌能力的影響 在Nisin標準溶液中分別加入與Nisin質(zhì)量的1%相當?shù)臍ぞ厶侨芤?，分別調(diào)節(jié)至不同的pH(2.0、4.0、5.5、6.0、6.5、6.8)，然后分別在不同溫度(30、45、60、75、90、110、121℃)下保持 20min，測定其效價。

1.2.2.3 殼聚糖濃度對Nisin抑菌能力的影響 在Nisin標準溶液中分別加入與Nisin質(zhì)量的0、0.3%、0.5%、1.0%、1.5%相當?shù)臍ぞ厶侨芤?，分別在常溫(pH2.0)、85℃ (pH4.0)、121℃ (pH6.5)下處理20min，測定其效價。

1.2.3 紅外光譜測定 取一定量樣品與KBr混合壓片，采用紅外光譜儀在掃描范圍為400～4000cm－1內(nèi)進行光譜掃描，分辨率為4cm－1。

1.2.4 差式掃描量熱分析 稱量液體樣品(6±0.2)mg于鋁盒中壓片，用DSC對樣品進行測定，測定參數(shù):掃描溫度范圍為 20～200℃，升溫速率為10℃·min－1，以 99.999% 高純氮氣作為載氣，流速25mL·min－1。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH和溫度對Nisin抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖1可知，pH和溫度對Nisin的抑菌能力均有顯著影響。同一溫度下，Nisin效價損失率隨著pH的升高而升高;而同一pH下，Nisin效價損失率也隨著溫度的升高而升高，這表明Nisin溶液的抑菌能力隨著pH或溫度的不斷升高而不斷降低，其抑菌活性減弱。這可能是因為Nisin是由34個氨基酸殘基組成的多肽化合物，氨基酸殘基及其作為抗菌活性分子的二聚體或是四聚體的結(jié)構(gòu)在高溫下遭到了破壞，從而影響了Nisin作用藤黃微球菌的效果。同時pH升高會使Nisin的溶解性和穩(wěn)定性降低，影響Nisin活性中心上必需基團的解離程度，活性也隨之降低［6－7］。當溫度為 30℃時，隨著 pH 的不斷上升，其效價損失率由原來的26.2%升高至77%，說明pH顯著影響Nisin的活性，抑菌作用得到抑制，但還具有一定的活性;但當溫度為121℃，pH由2.0上升到7.0時，其效價損失率由原來的26.2%升高至100%，說明在高溫條件下處理，pH的升高將顯著影響Nisin活性，且可引起其完全失活，這可能是因為在高pH時，Nisin分子內(nèi)部氫鍵斷裂，以其內(nèi)部的脫氫殘基易發(fā)生反應(yīng)形成多分子共聚物，同時高溫也促進了分子構(gòu)象的變化，這與江蕓［4］的研究結(jié)果一致。

圖1 pH和溫度對Nisin抑菌能力的影響Fig.1 Effect of pH and temperature on the antibacterial activity of Nisin

2.2 殼聚糖對Nisin抑菌穩(wěn)定性的影響

2.2.1 殼聚糖存在情況下pH和溫度對Nisin抑菌能力的影響 由圖2可知，在1%殼聚糖存在的條件下，Nisin的效價損失率隨pH的升高先保持不變而后逐漸升高。當溫度低于90℃時，在pH2.0～6.0的范圍內(nèi)，Nisin效價損失基本保持不變，pH大于6.0后，Nisin效價損失隨著pH的升高而急劇升高;但在近中性pH時，殼聚糖的溶解度降低，進而對Nisin的保護作用也隨之降低。此外，添加1%殼聚糖后，在pH2.0、4.0、5.5時，溫度對Nisin的效價損失基本沒有影響。當pH6.0，溫度低于90℃時，Nisin由于受到殼聚糖的保護，效價損失不大，但當溫度大于90℃時，Nisin效價損失則隨著溫度增大而迅速增大。在近中性條件下(pH6.5、6.8)，溫度低于 80℃時，溫度對Nisin效價影響較小;但當溫度高于80℃時，Nisin效價損失則隨著溫度升高而快速上升，此時殼聚糖對Nisin的保護作用減弱。

圖2 添加殼聚糖時，pH和溫度對Nisin抑菌能力的影響Fig.2 Effect of pH and temperature on the antibacterial activity of Nisin with chitosan added

結(jié)合圖1～圖2可知，在殼聚糖存在的情況下，Nisin的效價損失率比未添加時總體都有大幅度的下降，說明殼聚糖的添加對Nisin的抑菌穩(wěn)定性具有較顯著的保護作用。這可能是因為殼聚糖分子中含有多個親水性基團，分子空間大，能結(jié)合大量的水分，具有很強的吸水性，能優(yōu)先與水結(jié)合，使得Nisin分子的溶劑化層水減少，進而導(dǎo)致溶劑化層表觀體積的減少，可移動性降低，使得Nisin分子結(jié)構(gòu)結(jié)合得更加緊密，從而能夠抵御外界環(huán)境的影響，保護了Nisin 分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)象穩(wěn)定性［8－10］。

2.2.2 殼聚糖濃度對Nisin抑菌能力的影響 如圖3所示，隨著殼聚糖濃度的增加，Nisin的效價損失率呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(pH2.0，常溫除外)。pH2.0、常溫條件下，Nisin的效價損失率基本保持在0%的水平。pH4.0、85℃的條件下，無殼聚糖添加時Nisin效價損失率為37.6%，當添加0.3%濃度的殼聚糖時，Nisin效價損失率顯著降低到4%，說明此時添加的殼聚糖對Nisin的效價起到了較大的保護作用;隨著殼聚糖濃度的繼續(xù)升高，Nisin的效價損失率也繼續(xù)降低，但趨勢變得平緩，到1%的濃度時，Nisin已經(jīng)基本無效價損失。在高溫、中性條件下(121℃、pH6.5)，當殼聚糖濃度低于1%時，Nisin效價損失率隨著殼聚糖濃度的升高而降低，當殼聚糖濃度大于1%時，Nisin效價損失率隨著殼聚糖濃度的升高反而略有升高，這可能是由于殼聚糖濃度過高，溶液變得很粘稠，反而對菌體具有一定的保護作用，表現(xiàn)為Nisin的效價損失率升高。

表1 殼聚糖對Nisin紅外光譜的影響Table 1 Effect of chitosan on Infrared spectrum of Nisin

圖3 殼聚糖濃度對Nisin抑菌能力的影響Fig.3 Effect of the concentration of chitosan on the antibacterial activity of Nisin

2.3 殼聚糖對Nisin抑菌活性影響的機制研究

2.3.1 殼聚糖對Nisin紅外圖譜的影響 添加1%殼聚糖的 Nisin紅外圖譜如圖4(樣品均在 pH6.5，115℃下處理15min)所示。添加1%殼聚糖對Nisin紅外圖譜的變化如表1。

由圖4可知，添加了1%殼聚糖的Nisin紅外光譜圖中，除了A、B、C、D四個吸收峰外，出現(xiàn)了其他吸收峰，分別是C－O伸縮振動峰和C－H面向彎曲振動峰。而A、B、C、D四個吸收峰是液態(tài)水的吸收峰，說明在pH6.5，115℃下處理15min后，Nisin的活性基團受到破壞，活性已經(jīng)完全喪失。而在添加了殼聚糖的Nisin紅外光譜圖出現(xiàn)了新的吸收峰，表明它與Nisin分子間存在比較強的分子間作用力，形成了C－O、C－H鍵的結(jié)合，與 Nisin分子形成了氫鍵，C－O、C－H之間的作用增強，從而保護了Nisin原有的分子結(jié)構(gòu)和活性基團，對穩(wěn)定Nisin的空間構(gòu)象、提高其穩(wěn)定性有著明顯的作用。

圖4 添加殼聚糖的Nisin紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrogram of Nisin with chitosan added

由表1所示可知，O－H伸縮振動峰、O－H搖擺振動峰出現(xiàn)了右移，且均向低波數(shù)方向有較大的移動。說明殼聚糖與Nisin之間形成了氫鍵，分子間締合作用和水合作用增強。而氫鍵的形成能夠抑制pH和溫度對Nisin所帶來的負面影響，防止其結(jié)構(gòu)受外界環(huán)境作用而遭受破壞。這種分子間的作用力增加了Nisin空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

2.3.2 殼聚糖對Nisin熱穩(wěn)定性的影響 當添加了1%殼聚糖的 Nisin在pH4.0、85℃加熱20min后，其效價損失率分別由未添加時的31%降到了0.3%，說明殼聚糖對Nisin的穩(wěn)定性有著極強的保護作用(圖1、圖 2)。由 DSC圖譜可知，經(jīng) pH4.0、85℃ 加熱20min后，Nisin的熱變性溫度由pH2.0、常溫下處理的172.78℃降至現(xiàn)在的152.13℃。其可能的機制是pH與熱處理相結(jié)合導(dǎo)致Nisin內(nèi)部疏水基團更多暴露在外，Nisin的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，影響到活性基團的作用效果［11］。而殼聚糖的加入將變性溫度提高到了177.62℃。表明其對Nisin空間構(gòu)象的穩(wěn)定性有著顯著的保護效果。殼聚糖的羥基能夠替代水分子，同Nisin分子的某些基團存在著氫鍵結(jié)合，且這種結(jié)合明顯地提高了Nisin分子的熱變性溫度。

圖5 不同條件處理20min后的Nisin差示掃描量熱譜圖Fig.5 Thermogram of Nisin in different conditions for 20min

3 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明殼聚糖可以顯著改善Nisin的抑菌穩(wěn)定性。在殼聚糖存在的條件下，Nisin的效價損失率隨溫度及pH的升高先保持不變而后顯著增加，在不同的溫度及pH條件下，其保護效果有所差異。殼聚糖濃度在1%時改善效果最好。紅外光譜分析顯示，添加殼聚糖的Nisin紅外光譜圖表明殼聚糖與Nisin分子形成了氫鍵結(jié)合，穩(wěn)定了Nisin的構(gòu)象。DSC圖譜分析顯示，添加殼聚糖可以提高Nisin的變性溫度，改善其熱穩(wěn)定性，從而改善了其抑菌穩(wěn)定性。

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