杜仲內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物對大腸桿菌的作用機理研究

姜交龍，張 濤，江 波，沐萬孟，繆 銘

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv)始載于《本草綱目》，是一種落葉喬木，為單科單屬單種的稀有刁遺植物，有“活化石植物”之稱，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，屬于國家二類保護植物［1］。研究表明，杜仲各組織中含有如綠原酸、京尼平甙、桃葉珊瑚甙等成分，具有抗氧化、抗菌、抗病毒等藥理作用［1－3］。植物內(nèi)生真菌是指生長在健康植物體的根、莖及葉等組織中的細胞間隙或者細胞內(nèi)的一類真菌，是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分［4－6］。內(nèi)生真菌幾乎存在于所有目前已經(jīng)研究過的植物之中。近年來的研究發(fā)現(xiàn):生活在植物體的內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同或者相似的具有生理活性的代謝產(chǎn)物［7－9］。因此，開發(fā)和利用植物內(nèi)生真菌在保護植物物種資源、探索新的產(chǎn)物等方面都有著重要的意義。本文以從杜仲中篩選到的一株具有較高抑菌活性的內(nèi)生真菌Y18為出發(fā)菌株，研究其代謝產(chǎn)物對大腸桿菌細胞膜通透性、全細胞蛋白質(zhì)以及核酸結(jié)構等方面的影響，為內(nèi)生真菌資源開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

碘化丙啶(PI) 北京泛博生化公司;乙酸乙酯等 分析純;大腸桿菌 本實驗室保存;大腸桿菌培養(yǎng) LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、水1L);真菌活化培養(yǎng) PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g，水1L);發(fā)酵培養(yǎng) 察氏培養(yǎng)基(蛋白胨 10g、蔗糖 30g、K2HPO41g、KCl 0.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g、水 1L);杜仲內(nèi)生真菌 Y18自行篩選，分離步驟［6－7］:取健康的杜仲葉，洗凈晾干，在無菌的條件下用75%的乙醇浸泡3min，然后用無菌水漂洗;再用2%的NaClO溶液漂洗2min，最后用無菌水漂洗3次，風干;將表面消毒處理后的杜仲葉剪成1cm左右的小塊，加入到含有青霉素的PDA培養(yǎng)基內(nèi)，28℃下培養(yǎng)，待切口處長出菌絲，挑至新鮮的PDA培養(yǎng)基中，采用菌絲頂端純化法逐步純化。

BD FACS Calibur流式細胞分選儀 美國BD公司;NICOLET NEXUS 470傅里葉變換紅外光譜儀美國Thermo Electron;YSI3200電導儀 美國YSI。

1.2 實驗方法

1.2.1 內(nèi)生真菌Y18代謝產(chǎn)物制備 將內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)接于 PDA固體培養(yǎng)基，28℃活化2d，然后接種于250mL三角瓶中(含PDA液體培養(yǎng)基50mL)，28℃，150r/min培養(yǎng)3d，作為種子培養(yǎng)基。以5%(v/v)接種量轉(zhuǎn)入500mL三角瓶中(含察氏培養(yǎng)基200mL)，28℃，150r/min培養(yǎng)7d。發(fā)酵結(jié)束后，過濾除去菌絲體。濾液用等體積的乙酸乙酯分3次萃取，合并有機相，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至浸膏，60℃烘干稱重，用無菌水溶解制成100mg/mL，備用。

1.2.2 Y18 代謝產(chǎn)物對細胞膜滲透性的影響［10－11］取對數(shù)生長期的大腸桿菌，4℃、6000r/min離心3min。用5%的葡萄糖溶液洗滌2次，重懸，分成多個等分備用。取4mL配好的菌懸液與1mL Y18代謝產(chǎn)物作用一段時間，離心取上清液測電導率。0min時的電導率記為L1，作用一段時間后記為L2;將4mL菌懸液與1mL蒸餾水煮沸5min，冷卻離心取上清液，測電導率為L0。相對電導率為:(L2－L1)/L0。

1.2.3 流式細胞儀分析細菌細胞膜完整性 將培養(yǎng)至對數(shù)期的大腸桿菌4℃、6000r/min離心3min，用0.85%的無菌生理鹽水洗滌2次，重懸、稀釋至菌體濃度為108～109cfu/mL左右，備用。取4mL菌液加入1mL Y18代謝產(chǎn)物，37℃培養(yǎng)，以生理鹽水為陰性對照。在處理前后的樣品中均加入PI至終濃度為50μg/mL，37℃避光培養(yǎng)30min 后，4℃、6000r/min 離心3min，用無菌生理鹽水洗滌2次除去過量的PI，用流式細胞儀 FACS Calibur檢測［12］。

1.2.4 全細胞蛋白變性情況分析 樣品處理方法同1.2.3。取500μL樣品平鋪于ZeSe晶體片上，在常溫下烘干，使其形成一層均勻的菌膜。使用FT－IR光譜檢測儀進行檢測，檢測方法為衰減全反射法。操作參數(shù)為:檢測波數(shù)范圍為4000～500cm－1，分辨率4cm－1，掃描次數(shù)32次。紅外光譜采用OMNIC軟件進行分析［13－16］。

2 結(jié)果與討論

2.1 Y18代謝產(chǎn)物對大腸桿菌細胞膜滲透性的影響

Y18代謝產(chǎn)物對大腸桿菌細胞膜滲透性的影響如圖1所示，作用4h后，相對電導率增大了16.22%，說明菌懸液中的離子濃度變大，推測大腸桿菌細胞膜的通透性受到了影響，細胞內(nèi)離子的泄漏，從而使得相對電導率增大。

2.2 流式細胞儀分析細菌細胞膜完整性

圖1 Y18代謝物對大腸桿菌菌懸液電導率的影響Fig.1 Effect of the metabolites of Y18 on the relative electric conductivity

PI是一種DNA結(jié)合性染料，它可以鍥入雙鏈核苷酸中，使其在635nm附近發(fā)射紅色熒光而被流式細胞儀檢測。PI無膜通透性，不能透過完整結(jié)構細胞膜。因此，PI標記的細胞可以視為細胞膜損傷的細胞［12］。由圖2可知，Y18代謝產(chǎn)物處理前 E.coli(圖a)PI標記為陰性，表明處理前E.coli細胞膜完整。經(jīng)過Y18代謝產(chǎn)物處理后(圖b～圖d為分別處理1、2、4h)，E.coli細胞不同程度被 PI染色，表明Y18代謝產(chǎn)物破壞了細胞膜的完整性，細胞膜通透性增強，PI進入細胞內(nèi)部，從而與DNA結(jié)合，被FCM檢測到熒光。由圖3可知，經(jīng)過4h后，陽性細胞的比例達到25.31%。

圖2 Y18代謝物處理的E.coli PI染色FCM熒光直方圖Fig.2 The fluorescence historgrams of E.coli cells stained by PI in the metabolites treatments

2.3 紅外光譜二階導數(shù)處理

FT－IR光譜技術作為一種綜合檢測細菌生理狀態(tài)的有效方法，近年來得到廣泛地應用［13－15］。圖4是處理前后大腸桿菌的紅外圖譜。由圖可知，處理前后圖譜的變化微小，從原始紅外圖譜中無法準確分辨出峰位的變化。通常要對其進行處理，解析圖譜中包含的信息。常用的數(shù)據(jù)處理方法有二階導數(shù)處理和去卷積處理［15－16］。

圖3 Y18代謝物處理后E.coli PI陽性細胞比例Fig.3 The percentage of PI－stained E.coli in the metabolites treatments

圖4 處理前后大腸桿菌紅外圖譜Fig.4 Representative FT－IR spectra of control and treated samples of E.coli

圖5a是大腸桿菌在1700～1600cm－1下的二階導數(shù)圖譜。在紅外光譜中，1700～1600cm－1代表蛋白物質(zhì)酰胺 I帶 C=O伸縮振動。其中，1682cm－1和1674cm－1的峰代表 β 轉(zhuǎn)角，1660cm－1處的峰代表無規(guī)轉(zhuǎn)曲，1644cm－1的峰代表 α 螺旋，1638cm－1和1630cm－1的峰代表 β 折疊［15］。由圖5a可見，處理后大腸桿菌細胞蛋白質(zhì)結(jié)構發(fā)生變化，其中全細胞蛋白β折疊(1638cm－1和1630cm－1)變化得最為明顯;圖 5b 中，處理前后在 2957、2919、2872cm－1波數(shù)處發(fā)生了明顯的變化，這三處吸收峰分別代表著CH3反對稱伸縮振動、CH2反對稱伸縮振動以及CH3對稱伸縮振動，主要反映的是細胞膜的變化。這也進一步說明了處理后大腸桿菌細胞膜結(jié)構被破壞;圖5c中1220、1120cm－1的吸收峰發(fā)生了明顯的變化，這兩處的峰分別代表著核酸骨架中的P=O反對稱伸縮振動和C－C反對稱伸縮振動，主要反映了大腸桿菌細胞核物質(zhì)結(jié)構的變化，說明處理后大腸桿菌細胞內(nèi)的核酸物質(zhì)遭到一定程度的破壞。通過對二階導數(shù)譜圖分析可知，處理后的大腸桿菌細胞膜、蛋白質(zhì)和核酸結(jié)構均遭到一定的破壞。

2.4 全細胞蛋白變性情況分析

從二階導數(shù)譜圖中可以看出，處理后大腸桿菌全細胞蛋白結(jié)構發(fā)生了變化，其中蛋白 β折疊(1638cm－1和1630cm－1)變化得最為明顯。為了進一步對全細胞蛋白變性情況進行定量分析，采用PeakFit軟件對酰胺Ⅰ帶進行擬合［15－16］。

圖6左圖表示了處理前后紅外原始圖譜(上)、二階導數(shù)圖譜(中)和去卷積圖譜(下)。二階導數(shù)圖譜的峰形向下，去卷積圖譜峰形向上。結(jié)合兩種譜圖共同分析，當某個波數(shù)下在兩圖譜中都有吸收峰對應時，說明此吸收峰的可信度較高。根據(jù)文獻報道［14－16］，可以總結(jié)蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶區(qū) β 轉(zhuǎn)角(1674、1683、1688cm－1)、無規(guī)卷曲結(jié)構(1660、1667cm－1)、α螺旋結(jié)構(1644、1652cm－1)和 β 折疊結(jié)構(1609、1618、1624、1630、1635cm－1)及對應的吸收峰波數(shù)。通過圖6可知，大腸桿菌在處理前后二階導數(shù)圖譜和去卷積圖譜對應較好，可以明顯的分辨出上述12個吸收峰。

圖5 處理前后大腸桿菌二階導數(shù)圖譜Fig.5 Representative second－derivative FT－IR spectra of control and treated samples of E.coli

結(jié)合二階導數(shù)譜和去卷積譜，通過PeakFit軟件對酰胺Ⅰ帶進行擬合［15］。結(jié)果如表1所示，蛋白結(jié)構變化主要是β折疊增加，由處理前的34.60%增加到41.47%，變化最為明顯。α螺旋、無規(guī)卷曲、β轉(zhuǎn)角結(jié)構均有降低，其中，無規(guī)卷曲由21.80%下降到18.67%，下降最為明顯。

表1 處理前后對大腸桿菌蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶二級結(jié)構的定量分析Table 1 Quantitative estimation of the secondary structures of proteins of control and treated samples of E.coli

3 結(jié)論

圖6 處理前后大腸桿菌酰胺Ⅰ帶二階導數(shù)去卷積譜以及擬合譜圖Fig.6 The second－derivative spectra and the amideI of protein fitting bands of control and treated samples of E.coli

本文通過對大腸桿菌細胞膜通透性、全細胞蛋白質(zhì)以及核酸結(jié)構等檢測，分析杜仲內(nèi)生真菌Y18代謝產(chǎn)物對大腸桿菌作用的機理。通過上述實驗，可以得出如下結(jié)論:內(nèi)生真菌Y18代謝產(chǎn)物對大腸桿菌細胞膜影響比較明顯。處理4h后，大腸桿菌菌液相對電導率為16.22%，PI陽性細胞的比例達到25.31%。PI是一種DNA結(jié)合性染料，PI無膜通透性，不能透過完整結(jié)構細胞膜，因此，PI陽性細胞表明其細胞膜受到損傷。細胞膜的損傷導致細胞內(nèi)物質(zhì)流出，所以相對電導率增大。從二階導數(shù)譜中可以看出，全細胞蛋白質(zhì)結(jié)構發(fā)生了明顯的變化。蛋白結(jié)構變化主要是β折疊增加，由處理前的34.60%增加到41.47%;α螺旋、無規(guī)卷曲、β轉(zhuǎn)角結(jié)構均有降低，無規(guī)卷曲由21.80%下降到18.67%，下降最為明顯。從二階導數(shù)譜中可以看出，1220cm－1和1120cm－1的吸收峰發(fā)生了明顯的變化，這兩處的峰分別代表著核酸骨架中的P=O反對稱伸縮振動和C－C反對稱伸縮振動，主要反映了大腸桿菌細胞核物質(zhì)結(jié)構的變化。

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