超高壓加工對菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶活力和構(gòu)象的影響

劉 苗，繆 銘，張 濤，張 瑜，江 波

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122)

超高壓加工(High Pressure Processing，HPP)技術(shù)是一種新型非熱加工技術(shù)，可應(yīng)用于食品殺菌、鈍酶及食品保鮮等方面［1－2］，還可應(yīng)用于蛋白質(zhì)和淀粉等生物大分子的結(jié)構(gòu)研究［3］。隨著超高壓加工在理論和技術(shù)方面研究的不斷深入，有關(guān)壓力處理對酶影響的研究越來越多。相關(guān)研究表明超高壓加工不僅能鈍化酶，也可將酶激活并提高酶的穩(wěn)定性和活力［4］，但國內(nèi)外當(dāng)前對超高壓在激酶方面研究還相對較少。一般低壓(小于300MPa)處理對酶有激活作用(激酶效應(yīng))，高壓(大于300MPa)可鈍化酶［5］。低壓可使維持酶二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的各種非共價(jià)鍵(如氫鍵、離子鍵、范德華力和疏水相互作用等)更穩(wěn)定或使酶活性位點(diǎn)發(fā)生變化而有利于底物的結(jié)合，而高壓可破壞酶的各種非共價(jià)鍵導(dǎo)致酶構(gòu)象改變，酶活力隨之改變［6］。菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶(Inulin Fructotransferase，即 IFTase，EC4.2.2.18)能從菊糖的非還原性末端裂解出兩分子果糖并使其脫水形成類環(huán)狀二糖酐——雙果糖酐III［7］。雙果糖酐III(Difrucose anhydride III，DFA III)是一種新型的天然功能性甜味劑。國內(nèi)當(dāng)前僅有本實(shí)驗(yàn)室對A.aurescens SK8.001產(chǎn)菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)及分子生物學(xué)方面和DFA III酶法合成進(jìn)行了研究［7］。由于適當(dāng)?shù)奶岣邏毫仗枪寝D(zhuǎn)移酶有激活作用，因此本研究以菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶為研究對象，運(yùn)用熒光光譜和圓二色譜等方法研究壓力處理后菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶構(gòu)象的變化，并結(jié)合酶活力的變化，分析壓力處理后的酶構(gòu)象變化與酶活力大小之間的聯(lián)系，為超高壓加工技術(shù)在激酶方面的研究提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶 實(shí)驗(yàn)室自制;DFA III標(biāo)準(zhǔn)品 和光純藥工業(yè)株式會(huì)社;菊糖 比利時(shí)Beneo－Orafti公司。

超高壓儀器 S－FL－085－09－W 英國 Stansted Fluid Power公司;高效液相色譜儀Agilent 1100 美國安捷倫公司;圓二色譜儀MOS－450 AF－CD 法國Biologic公司;熒光光譜儀F－7000 FL 日本Hitachi公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶活力檢測 菊糖2%1mL，100mmol/L、pH5.5醋酸鈉緩沖液和適量的酶液，總體積2mL，60℃水浴 15min后，沸水浴 10min滅酶。HPLC法測定DFAⅢ的生成量(Sugarpak1鈣型陽離子交換柱;柱溫:85℃;流動(dòng)相:超純水(經(jīng)0.22μm膜過濾);洗脫流速:0.4mL/min;上樣體積:10μL;檢測器:示差折光率檢測器)。

酶活定義:在 60℃，pH5.5條件下，1min產(chǎn)生1.0μmol DFAⅢ所需的酶量為 1個(gè)酶活力單位(U/mL)。未經(jīng)處理的原酶液(未處理組)的相對酶活力為100%。

1.2.2 不同壓力對菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的影響 在80℃條件下，將酶液分別在 0.1、100、150、200、250、300、350、400MPa下處理10min，卸壓后立即進(jìn)行光譜檢測及酶活力測定。

1.2.3 不同保壓時(shí)間對菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的影響 在80℃條件下，將酶液在0.1MPa和200MPa下分別處理 10、20、30、40、60min，卸壓后立即進(jìn)行光譜檢測及酶活力測定。

1.2.4 熒光光譜檢測 激發(fā)波長為286nm，掃描范圍300～400nm，掃描速度為12000nm/min，狹縫寬度為5nm，PMT電壓為400V，室溫下重復(fù)掃描3次?？瞻诪?00mmol/L、pH5.5的醋酸鈉緩沖液，熒光強(qiáng)度值為扣除空白后的相對值。未處理組的相對熒光強(qiáng)度為100%。

1.2.5 圓二色譜檢測 以100mmol/L、pH5.5醋酸鈉緩沖液為空白，比色皿厚度0.1cm，掃描范圍190～250nm，室溫下重復(fù)掃描3次，掃描速度30nm/min。圓二色性用平均殘基橢圓值［θ］·10－5表示，單位為deg·cm2/dmol。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光光譜分析

在酶蛋白分子中，色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)及苯丙氨酸(Phe)這三種芳香族氨基酸由于側(cè)鏈生色基團(tuán)的不同而有不同的熒光強(qiáng)度，Phe、Tyr、Trp的相對熒光強(qiáng)度分別為0.5、9和100，而Phe殘基在一般情況下很難被激發(fā)，因此酶的內(nèi)源熒光主要由Trp和Tyr產(chǎn)生。Tyr熒光光譜最大發(fā)射波長一般位于303nm左右，由于Trp殘基對微環(huán)境的變化很敏感，導(dǎo)致其峰位多在325～350nm之間變動(dòng)［8］。菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶是一種單體酶，其氨基酸序列中有9個(gè)Tyr殘基和2個(gè)Trp殘基。壓力處理通過影響非共價(jià)鍵可改變酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，現(xiàn)運(yùn)用內(nèi)源熒光光譜來研究壓力處理后酶三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

如表1所示，當(dāng)激發(fā)波長為286nm時(shí)，壓力處理前后的酶最大發(fā)射峰位在343～353nm范圍內(nèi)變動(dòng)，這表明菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的內(nèi)源熒光主要來自Trp殘基，這可能是由于酶分子的Tyr殘基到Trp殘基之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致Tyr殘基的熒光淬滅和Trp殘基的熒光增強(qiáng)［9］，由此推斷菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶屬于B類蛋白，其內(nèi)源熒光光譜實(shí)際上是Trp殘基的熒光光譜。壓力處理后的酶結(jié)構(gòu)變化運(yùn)用酶內(nèi)源熒光光譜檢測，即表現(xiàn)為壓力處理后Trp殘基微環(huán)境變化。

表1 不同壓力對菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶熒光峰位及熒光強(qiáng)度和酶活力的影響Table 1 Effect of different pressure on the fluorescence peak/intensity and IFTase activity

未經(jīng)處理的原酶液(未處理組)的最大發(fā)射峰位在343.4nm，最大熒光強(qiáng)度為531.4，經(jīng)常壓80℃處理后，與未處理組相比，酶活力和熒光強(qiáng)度均降低了12%左右。但經(jīng)100、150、200MPa的壓力處理后其相對酶活力分別提高了8%、5%和9%，這表明適當(dāng)?shù)奶岣邏毫Σ粌H可抵抗酶的熱失活，而且使酶的催化活力增強(qiáng)，其原因是高溫使酶分子結(jié)構(gòu)變的不穩(wěn)定而導(dǎo)致酶活降低，而壓力處理能維持酶結(jié)構(gòu)的微觀有序性［10－11］，使酶結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定以抵抗酶的熱失活;同時(shí)，熒光峰位發(fā)生一定程度的紅移，最大發(fā)射峰的波長增大了2～3nm，與未處理組相比，最大熒光強(qiáng)度增加了1%左右，表明壓力處理后酶結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致一定數(shù)量的Trp殘基外露，導(dǎo)致熒光峰位紅移和熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，因而可以利用熒光強(qiáng)度和峰位的變化的來反映壓力引起的Trp殘基微環(huán)境的變化。隨著壓力的繼續(xù)增大，峰位的紅移也更加明顯，但酶活力和熒光強(qiáng)度均逐漸降低，當(dāng)壓力達(dá)到400MPa，酶活僅殘余7.8%，最大峰位紅移約10nm，相對熒光強(qiáng)度僅有66.88%，這表明過高的壓力(大于300MPa)明顯破壞了該酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，使酶嚴(yán)重失活。如圖1所示，各壓力處理后的相對酶活力和相對熒光強(qiáng)度之間呈較好的線性正相關(guān)(R2=0.9896)。以上結(jié)果表明酶活力變化與壓力引起的Trp微環(huán)境的變化有緊密聯(lián)系。

圖1 各壓力(100～400MPa)處理后的相對酶活力與相對熒光強(qiáng)度之間的相關(guān)性Fig.1 Correlation between relative enzyme activity and relative fluorescence intensity under different pressure(100～400MPa)

由表2分析可知，200MPa下，隨著保壓時(shí)間的延長，酶活逐漸升高，在保壓30min時(shí)相對酶活力達(dá)最大，為124.08%，繼續(xù)延長保壓時(shí)間，酶活又逐漸降低，當(dāng)保壓時(shí)間為 60min時(shí)，相對酶活力僅有73.27%。與酶活力隨保壓時(shí)間變化的趨勢類似，熒光強(qiáng)度也是隨著保壓時(shí)間的延長先升高再降低。其原因可能是壓力處理足夠的時(shí)間所帶來的能量可導(dǎo)致維持酶蛋白分子結(jié)構(gòu)的一些相互作用力(如氫鍵作用、疏水性作用、范德華力等)發(fā)生適當(dāng)?shù)淖兓@些變化導(dǎo)致酶三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化［12］進(jìn)而熒光強(qiáng)度增強(qiáng)和酶活力提高;但過長的保壓時(shí)間會(huì)使過量的水分子滲透到酶分子內(nèi)部，導(dǎo)致非極性基團(tuán)的接觸減少而引起酶結(jié)構(gòu)部分展開［12］，酶活力和熒光強(qiáng)度隨之降低。

表2 不同保壓時(shí)間對菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶熒光峰位及熒光強(qiáng)度和酶活的影響Table 2 Effect of different dwell time on the fluorescence peak/intensity and IFTase activity

如圖2所示，壓力處理后菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的相對酶活力與相對熒光強(qiáng)度之間呈較好的線性正相關(guān)(R2=0.9976);而隨著常壓高溫處理時(shí)間的延長，相對酶活力逐漸降低，熒光強(qiáng)度則逐漸升高，其相對酶活力與相對熒光強(qiáng)度之間呈線性負(fù)相關(guān)(R2=0.9328)。Mozhaev等［13］認(rèn)為酶熱失活的初始步驟是必要水分子的大量流失而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)重排，適當(dāng)?shù)膲毫μ幚韯t通過電荷基團(tuán)和非極性基團(tuán)的水化作用來阻止這一過程，過高的壓力會(huì)迫使水分子進(jìn)入蛋白質(zhì)分子內(nèi)部而引起蛋白質(zhì)的部分展開。這表明雖然高壓和高溫處理都可改變酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，但其機(jī)理明顯不同。

圖2 200MPa/0.1MPa處理不同時(shí)間后的相對酶活力與相對熒光強(qiáng)度之間的相關(guān)性Fig.2 Correlation between relative enzyme activity and relative fluorescence intensity at different time under 200MPa/0.1MPa

2.2 圓二色譜分析

由于包含發(fā)色團(tuán)的酶蛋白分子的不對稱性，引起左右兩圓偏振光具有不同的光吸收的現(xiàn)象，即圓二色性(circular dichroism，CD)，常用于溶液中酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究。

運(yùn)用圓二色譜分析壓力對菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如圖3所示。未經(jīng)處理的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的圓二色譜在219nm左右單有一個(gè)負(fù)峰，表明菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)以β－折疊為主。經(jīng)壓力(100～400MPa)處理后，負(fù)峰的峰型和峰位基本未變(見圖3和表3)，說明在實(shí)驗(yàn)壓力處理后菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的主體二級(jí)結(jié)構(gòu)未發(fā)生很明顯變化。有文獻(xiàn)報(bào)道［14］酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變發(fā)生在非常高的壓力條件(高于300～700MPa)下，還依賴于壓縮速率和二級(jí)結(jié)構(gòu)重排的程度，而這可導(dǎo)致酶的變性。本研究是在壓力(100～400MPa)處理后檢測酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)負(fù)峰值隨壓力的升高而逐漸升高，說明其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了微小的變化，但當(dāng)處理壓力大于300MPa，即使是這微小的變化也會(huì)導(dǎo)致酶的嚴(yán)重失活。在100～400MPa的壓力范圍內(nèi)酶活力與219nm負(fù)峰值大小呈線性負(fù)相關(guān)(R2=0.9659)，如圖4，表明β－折疊是菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮催化活力的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖3 各壓力處理后的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的圓二色譜圖Fig.3 CD of the IFTase under the different pressure

表3 不同壓力對菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶圓二色性和酶活力的影響Table 3 Effect of different pressure on circular dichroism and IFTase activity

圖4 各壓力(100～400MPa)處理后的相對酶活力與219nm處的負(fù)峰值之間的相關(guān)性Fig.4 Correlation between relative enzyme activity and value of the negative peak at 219nm under different pressure(100～400MPa)

圖5 不同處理時(shí)間后的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的圓二色譜圖Fig.5 CD of IFTase under the different dwell time

由圖5(a)可知，與未處理組相比，219nm處的負(fù)峰值隨保壓時(shí)間的延長逐漸增大，相對酶活力則呈先上升后下降的趨勢，200MPa處理30min可使酶活提高最多(見表4)，而此時(shí)酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)與酶在自然狀態(tài)下的二級(jí)結(jié)構(gòu)不同。處理時(shí)間超過30min后，酶活則開始降低，且219nm處的負(fù)峰值變化較大，這表明保壓時(shí)間過長使酶二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生的變化可導(dǎo)致酶活降低。圖5(b)是常壓80℃處理10～60min后酶的圓二色譜圖，由圖可知，219nm處的負(fù)峰值變化不大，但酶活力損失較多，說明高溫處理10～60min可能對該酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響不大，而酶的部分熱失活可能與酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)(由酶的熒光光譜的結(jié)果可知)被破壞有關(guān)。

表4 不同保壓時(shí)間對菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶圓二色性和酶活的影響Table 4 Effect of different dwell time on circular dichroism and IFTase activity

3 結(jié)論

在80℃的條件下，壓力處理后的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的相對酶活力均隨著壓力的升高和保壓時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢，在壓力為200MPa、保壓時(shí)間為30min時(shí)相對酶活力達(dá)最大，表明適當(dāng)?shù)膲毫μ幚砟茉鰪?qiáng)酶的催化活力。菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的內(nèi)源熒光吸收主要來自Trp殘基，并結(jié)合壓力處理后該酶的相對酶活力和相對熒光強(qiáng)度之間呈線性相關(guān)的分析，可知酶活力變化與壓力處理后Trp微環(huán)境的變化有一定聯(lián)系。由圓二色譜的結(jié)果可知β－折疊是菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的主要二級(jí)結(jié)構(gòu)，219nm處的特征負(fù)峰值大小與相對酶活力呈負(fù)線性相關(guān)，表明β－折疊是該酶發(fā)揮催化活力的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。超高壓加工可提高菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶活力，與壓力處理后酶二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)，為超高壓加工提高酶活力的機(jī)理研究提供一定的理論依據(jù)。

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