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    水葫蘆總黃酮最佳提取工藝的研究

    2012-12-05 02:57:02陸廣匯
    關(guān)鍵詞:水葫蘆浸膏蘆丁

    陸廣匯

    (江蘇省建湖縣人民醫(yī)院,建湖224700)

    水葫蘆 (Water Hyacinth),屬雨久花科、鳳眼蓮屬[1]。原產(chǎn)南美,1884年作為觀賞植物被帶到美國的一個(gè)園藝博覽會(huì)上,當(dāng)時(shí)被預(yù)言為 “美化世界的淡紫色花冠”。1901年,水葫蘆被引入中國,已成為中國危害嚴(yán)重的外侵植物?,F(xiàn)在這種植物已成為我國大部分境內(nèi)迅速擴(kuò)散傳播的惡性雜草[2]。水葫蘆包含的主要成分有皂苷、揮發(fā)油和黃酮等,其乙醇提取物具有很強(qiáng)的抗氧化和自由基消除能力,在諸多類型天然抗氧化劑中[3],黃酮類成分能有效減輕細(xì)胞的過氧化脅迫,阻止低密度脂質(zhì)的過氧化等作用。為了綜合利用水葫蘆,使它變廢為寶[4],我們用植物類黃酮的獨(dú)特優(yōu)勢,確定水葫蘆總黃酮的最佳提取工藝,為后續(xù)開辟安全、無副作用的綠色化妝品提供便利[5]。

    1 水葫蘆提取工藝研究

    1.1 材料來源及處理 干燥水葫蘆打粉過40目篩備用[6]。

    1.2 正交實(shí)驗(yàn)表頭設(shè)計(jì)及總黃酮的提取 表頭設(shè)計(jì)見表1,正交實(shí)驗(yàn)見表2。

    表1 表頭設(shè)計(jì)

    表2 正交實(shí)驗(yàn)表

    上述試驗(yàn)藥材加熱回流得到乙醇提取液,揮去乙醇[7],干燥后得浸膏,稱重 (g),如表3。

    表3 浸膏質(zhì)量

    1.3 紫外法分光光度法 (UV)測定樣品中總黃酮含量

    1.3.1 儀器與試劑 752紫外可見分光光度計(jì) (上海精密科學(xué)儀器有限公司);蘆丁對(duì)照品:中國藥品生物制品鑒定所 (100080-200306);甲醇:色譜純;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉:分析純;蒸餾水。

    1.3.1 溶液配制 (1)5%亞硝酸鈉、10%硝酸鋁、1mol/L NaOH溶液。稱取亞硝酸鈉2.5g置50ml燒杯中,加水配制成5%亞硝酸鈉溶液;稱取硝酸鋁5g置50ml燒杯中,加水配制成10%硝酸鋁溶液;稱取NaOH 8g置200ml燒杯中,加水配制成1mol/L NaOH溶液。(2)對(duì)照品溶液配制。精密稱取干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品50mg置100ml容量瓶中,加甲醇適量,置水浴上微熱,使蘆丁溶解,放冷,加甲醇至刻度,搖勻,得0.5mg/ml對(duì)照品溶液。

    1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密量取對(duì)照品溶液 (0.5mg/ml)1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0ml分別置于25ml容量瓶中,各加水至6.0ml,加5%亞硝酸鈉溶液1ml,充分搖勻,放置6min,加入10%硝酸鋁溶液1ml,充分搖勻,放置6mim,加入1mol/L NaOH溶液10ml,再加水至刻度,搖勻,放置15min,于分光光度計(jì)上以第一份溶液為空白,在510nm波長[8],鎢燈,測定吸光度值A(chǔ),見表4,以A為縱坐標(biāo),對(duì)照品溶液濃度C為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)回歸分析得回歸方程:Y=11.711X,相關(guān)系數(shù)R2=0.9991,r=0.9995。

    表4 吸光度值A(chǔ)

    1.4 樣品溶液總黃酮含量測定 精密稱取浸膏0.25g,置100ml容量瓶中,加甲醇至刻度,再分別量取5ml置25ml容量瓶中,照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)的方法,自 “各加水至6ml”起依法操作,直至測定出樣品的吸光度值[9],再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量,見表5。

    表5 樣品溶液總黃酮含量測定

    1.5 高效液相 (HPLC)測定樣品中蘆丁含量

    1.5.1 儀器與試劑 Waters2690高效液相色譜儀,996PDA二極管矩陣檢測器,Millennium32色譜管理系統(tǒng);蘆丁對(duì)照品:中國藥品生物制品鑒定所 (100080-200306);甲醇:色譜純;重蒸餾水:自制。

    1.5.2 方法與結(jié)果 色譜條件的選擇和系統(tǒng)適用性試驗(yàn):Alltima C18柱 (4.6×250nm;5μm),柱溫為30℃;以甲醇-0.4%磷酸水 (30:70)為流動(dòng)相,流速為1.0ml/min;檢測波長為360nm。在上述色譜條件下,理論塔板數(shù)按蘆丁計(jì)算為6130[10]。

    1.5.3 溶液的配置 對(duì)照品溶液的制備:精密稱取蘆丁對(duì)照品適量,加甲醇制成每1ml含100μg的溶液。樣品溶液的制備:精密稱取水葫蘆浸膏0.25g,置100ml容量瓶中,加甲醇至刻度。精密吸取1ml溶液置25ml容量瓶中,加甲醇至刻度。

    1.5.4 方法學(xué)考察 ①外標(biāo)一點(diǎn)法[11]:稱取蘆丁對(duì)照品10mg,精密稱定,加甲醇制成對(duì)照品貯備液,再精密吸取上述對(duì)照品溶液0.8ml,用甲醇定容至5ml,吸取20μl對(duì)照品溶液注入液相色譜儀測定,得到其峰面積4129。②樣品含量測定:分別精密吸取樣品溶液20μl注入高效液相色譜儀測定,根據(jù)外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算結(jié)果,見表6。

    表6 樣品含量

    1.6 浸出物量的測定——冷浸法 精密稱取浸膏4g,置100ml錐形瓶中,精密加70%乙醇,密塞,冷浸,前6小時(shí)內(nèi)時(shí)時(shí)振搖,再靜置18小時(shí),用干燥濾器濾過,取20ml濾液[12]。揮去乙醇,干燥精密稱重 (g),見表7。

    表7 浸出物含量

    2 結(jié)果

    采用SPSS13.0進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

    2.1 紫外SPSS統(tǒng)計(jì)結(jié)果 見表8

    表8 總黃酮含量正交結(jié)果

    2.2 HPLCSPSS統(tǒng)計(jì)結(jié)果 見表9。

    表9 蘆丁含量正交結(jié)果

    3 正交加權(quán)統(tǒng)計(jì)結(jié)果 見表10。

    表10 正交加權(quán)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

    根據(jù)紫外、液相、浸出物結(jié)果的加權(quán),得出最佳提取工藝:70%的8倍于原藥材體積乙醇,提取3次,1.5h/次。

    5 討論

    水葫蘆中含有較為豐富的黃酮類成分[13],正交試驗(yàn)中影響提取的效率的4個(gè)因素 (乙醇濃度、乙醇體積、提取的時(shí)間、提取的次數(shù))中提取的時(shí)間和提取的次數(shù)影響較小,而乙醇的濃度影響顯著。因此用7%的8倍于原藥材體積乙醇,提取3次,1.5h/次,提取較完全[13]。

    水葫蘆乙醇提取物具有很強(qiáng)的抗氧化和自由基消除能力,而活性氧與自由基的產(chǎn)生被認(rèn)為與人類的眾多疾病的發(fā)生密切相關(guān)。在諸多類型天然抗氧化劑中[14],黃酮類成分能有效減輕細(xì)胞的過氧化脅迫,阻止低密度脂質(zhì)的過氧化,預(yù)防和治療多種疾病。通過對(duì)水葫蘆黃酮化合物提取工藝的研究,可以綜合利用水葫蘆,變廢為寶[15],同時(shí)可以擴(kuò)大藥源,極大的利用資源,具有良好的社會(huì)效益[16-17]。

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